Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l'esposizione a sostanze chimiche tossiche
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
L'esposizione a sostanze chimiche (compresi alchilanti agenti di guerra chimica come mostarde zolfo e di azoto) provoca una pletora di sintomi clinici tra cui il disturbo di guarigione delle ferite. Il processo fisiologico di guarigione della ferita è molto complessa. La formazione di tessuto di granulazione è un passo fondamentale in questo processo con un conseguente chiusura preliminare ferita e fornendo una rete di nuovi vasi sanguigni capillari – sia attraverso vasculogenesi (romanzo di formazione) o angiogenesi (germinazione delle navi esistenti). Sia vasculo- e angiogenesi richiedono funzionale, la migrazione diretta delle cellule endoteliali. Così, l'indagine della migrazione precoce delle cellule endoteliali (CEE) è importante per capire la fisiopatologia della chimica indotta guarigione delle ferite e disturbi potenzialmente individuare nuove strategie di intervento terapeutico.
Abbiamo valutato difficoltà nella guarigione dopo alchilanti esposizione agente e testati potenziali composti candidati treatment. Abbiamo usato una serie di tecniche descritte in questo protocollo. Una camera di Boyden modificato per investigare quantitativamente chemochinesi di CEE è descritta. Inoltre, l'uso di guarigione della ferita test in combinazione con analisi pista per valutare qualitativamente migrazione è illustrato. Infine, dimostriamo l'uso del TMRM colorante fluorescente per la ricerca del potenziale di membrana mitocondriale per identificare i sottostanti meccanismi della migrazione cellulare disturbato. Il protocollo che segue descrive le tecniche di base che sono state adattate per la ricerca di CEE.
Introduction
La migrazione delle cellule è importante in molti processi fisiologici e fisiopatologici, tra cui lo sviluppo, varie malattie, e la guarigione delle ferite dopo lesioni della pelle.
Dopo lesioni della pelle, infiammazione rimuove unità tessuti e granulazione danneggiati o necrotiche chiusura preliminare ferita e permette la formazione di una rete di nuovi capillari attraverso vasculogenesi (formazione romanzo) o angiogenesi (germinazione di vescicole esistenti) 1-3. Sia vasculo- e angiogenesi richiedono migrazione delle cellule endoteliali. La crescente rete di vasi sanguigni è essenziale per il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive al proliferare cheratinociti che alla fine subiscono cheratinizzazione, formare un nuovo epitelio e fornire la chiusura della ferita.
La migrazione deteriorate delle cellule endoteliali è una causa di fondo di guarigione delle ferite disturbo 4,5. Così, i metodi per valutare la migrazione delle cellule endoteliali primi sono tenuti a esplorare la pathophysiollogia dei disturbi di migrazione delle cellule e di individuare nuove strategie di intervento terapeutico.
Esposizione cutanea ad agenti alchilanti (ad esempio, zolfo e mostarde azoto) provoca la guarigione della ferita disturbo 6. Tali composti sono stati utilizzati come agenti di guerra chimica in molti conflitti nel 20 ° secolo e rimangono motivo di forte preoccupazione a causa di scorte esistenti in regioni politicamente instabili e relativamente semplice sintesi. Anche se la senape di zolfo fu sintetizzato nel 1822, la patologia molecolare e clinica di esposizione SM non è compreso nei dettagli e un antidoto per l'esposizione SM è stato identificato.
Sono stati condotti numerosi studi per comprendere e modellare difficoltà nella guarigione dopo l'esposizione SM e per testare potenziali composti candidati capaci di riservare tale effetto. Schmidt et al. (2009) testato l'effetto di clorambucile, un composto alchilante con proprietà simili a SM in moumodelli corpo embrioide sé e ha trovato una drammatica, a volte riduzione oltre il 99% in formazione dei vasi 7. Questo effetto negativo è stato più pronunciato in una fase di sviluppo che, in condizioni fisiologiche, è dominato dalla proliferazione e la migrazione delle cellule precursori endoteliali vascolari. Così, queste cellule sono state identificate per essere particolarmente sensibile agli agenti alchilanti. Steinritz et al. (2010) testato scavengers di specie reattive dell'ossigeno (ROS), in particolare N-acetilcisteina (NAC) e acido linolenico alfa (ALA) per la loro capacità di ridurre la tossicità SM in modelli di topo embrioide corpo e in particolare, per ripristinare la formazione dei vasi 8. Sono stati osservati effetti protettivi temporanei, che indica che l'eccessiva formazione di ROS è stato in grado di contribuire agli effetti negativi della SM sulla guarigione delle ferite. Questi effetti non sono permanenti e due composti candidati possono non essere in grado di ripristinare la formazione dei vasi e la guarigione della ferita a lungo termine 8. However, quegli esperimenti sono stati condotti in un modello complesso in 3D che ha fatto autorizzazione di indagare su migrazione cellulare. Così, abbiamo successivamente testato NAC e ALA per gli effetti benefici sulla migrazione cellulare di CEE, che hanno un ruolo chiave nel processo di formazione dei vasi 9.
Inoltre, è dimostrato che la polarità cellulare è necessaria per la migrazione delle cellule. Disfunzione mitocondriale che porta alla formazione di ROS ha dimostrato di ridurre la polarità delle cellule e può quindi influenzare negativamente la migrazione delle cellule. Pertanto, cellule vive quanto riguarda la funzione mitocondriale è stata eseguita e gli effetti di scavengers ROS sono stati esaminati. Il protocollo che segue descrive i requisiti generali per la coltivazione della CEE, del test camera di Boyden, la guarigione della ferita test tra cui l'analisi di monitoraggio delle cellule e l'uso di TMRM per la valutazione della funzione mitocondriale nei dettagli. Aspetti importanti di protocolli sperimentali per la coltivazione CEE e la migrazione sono evidenziati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esposizione cutanea a sostanze chimiche tossiche si traduce spesso in grave disturbo guarigione delle ferite. I meccanismi alla base sono in gran parte sconosciuti. La guarigione della ferita è un processo complesso che si compone di diverse fasi (emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento). Migrazione cellulare è coinvolto in ogni fase, tuttavia, è di fondamentale importanza per la formazione del tessuto di granulazione. Qui, nuovi vasi sanguigni si formano mediante angio o vasculogenesi.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
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