세포막의 수송체는 세포막 또는 세포층을 가로질러 이온을 차등적으로 분리할 수 있으며 조직 생리학, 복구 및 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 우리는 생체 내에서 단일 세포 및 조직에서 특정 이온 플럭스를 측정할 수 있는 이온 선택적 자체 참조 미세전극에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
동물, 식물 및 단일 세포로부터 세포 외부로부터 세포질을 분리 세포막라는 장벽에 의해 밀폐된다. 이러한 상피 세포층로서 또한 외부 또는 다세포 유기체의 다른 구획에서 내부를 분리 장벽을 형성한다. 이러한 장벽의 주요 기능은 세포막 또는 세포 층에 걸쳐 이온의 미분 분포이다. 두 속성이 배포 허용 : 1) 막과 상피 특정 이온에 선택적 투과성을 표시; 2) 이온은 세포막 및 세포 층에 걸쳐 펌프를 통해 운반된다. 이러한 속성은 조직의 생리를 유지하는 중요한 역할을 수리하는 동안, 손상 후 신호를 신호로 작동, 또는 병적 인 상태에서. 이온 선택적 자체 참조 미세 전극은 단일 세포와 조직 수준의 칼슘, 칼륨, 나트륨 등의 이온의 특정 플럭스를 측정 할 수 있습니다. 미세 전극은 이온 운반체 칵테일을 포함특정 이온에 선택적으로 투과. 내부 도금액 관심 이온 농도 세트를 포함한다. 미세 전극의 전위는 이온의 외측 농도에 의해 결정된다. 이온 농도의 변화에 따라, 미세 전극의 전위는 이온 활성의 로그 함수로서 변화시킨다. (인해 이온 플럭스 농도 구배 예) 앞뒤로 이온의 소스 또는 싱크 가까이 이동할 때 미세 전극 전위는 이온 플럭스 / 구배에 비례하는 진폭 변동한다. 증폭기는 미세 신호를 증폭하고 출력은 컴퓨터 상에 기록된다. 이온 플럭스는 그러한 특정 이온 이동성 전극 전위 변동, 미세 전극의 편위 및 다른 파라미터를 이용하여 픽의 확산 법칙에 의해 계산 될 수있다. 본 논문에서는, 우리는 이온 선택적 자체 참조 미세 전극을 사용하여 세포 외 이온 플럭스를 측정하는 방법 상세 설명몇 가지 대표적인 결과를 제시 거라고.
서론
모든 동물 세포는 외부 환경으로부터 세포질을 분리 지질 이중층 막에 의해 둘러싸여있다. 셀 이온 (1)의 능동 수송에 의해, 내부 전기 막 잠재력, 음을 유지합니다. 막 전위는 셀이 막 (2)에 다양한 분자 장치를 조작하기 위해 활용할 수있는 저장된 에너지 원이다. 뉴런과 다른 흥분성 세포는 큰 막 잠재력을 가지고있다. 나트륨 채널의 신속한 개폐는 막 전위 (탈분극)을 축소하고 신경 세포 (2)의 길이를 따라 이송되는 활동 전위를 생성한다. 이외에도 이러한 급격한 전기 변화에서, 많은 조직과 장기 생성하고 중요한 장기 전기 잠재력을 유지한다. 예를 들어, 피부 및 각막 상피 생성 및 이온의 펌핑 방향 (주로 나트륨 및 염화물) (3)에 의해 트랜스 - 상피 세포 외 전위 및 전류를 유지한다.
내인성 세포 외 전류의 측정은 진동 프로브 4-6과 세포막과 상피 세포층의 전기 파라미터의 측정을 허용 미세 전극 시스템 7-10를 사용하여 막 또는 트랜스 - 상피 전위의 측정을 사용하는 동안 십t "> 이들은 아무 수득 관련된 이온 종의 표시.선택적 이온 운반체와 미소 전극은 용액에서 특정 이온 농도를 측정 할 ....
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프로토콜
1. 이온 선택적 자체 참조 바께 미세 준비
- 이온 선택성 미소 전극의 제조
- 열은 미세 풀러를 사용하여 필라멘트 (1.5 mm 외경 1.12 mm 내경)없이 얇은 벽으로 둘러싸인 붕규산 모세 혈관을 당깁니다.
참고 :이 팁을 직경 3-4 μm의를 제공합니다. 작은 팁 전자 노이즈에 미소 전극이 더 민감하게하고 또한 이온 농도의 변화에 더 느리게 응답과 연관된 더 높은 저항을 갖는다. 유용한 정보는 스미스 외. (26)에 의해 발표 된 논문에서 찾을 수 있습니다. - 친 지성 이온 운반체 칵테일의 유지를 돕기 위해 내면 소수성을 렌더링하는 전극 silanization합니다. 를 건조> 100 ℃의 오븐에서 금속 랙 및 열 O / N에 미소 전극을 배치합니다. 랙은 2mm 직경의 구멍과 금속판을 통해 방법의 일부를 천공한다. ml의 G 구멍에 전극 (250) 위쪽 팁 배치그들에 아가씨 커.
- 아침에, 오븐을 끄고 절연 장갑을 착용하고있는 동안, 조심스럽게 자리에 전극과 비커와 금속 선반을 제거합니다. 열을 유지하기 위해 오븐 문을 닫습니다.
- 라텍스 또는 니트릴 장갑, 실험실 코트와 눈 보호구를 착용 할 것. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로, 각 전극의 기지에서 실란 ....
- 열은 미세 풀러를 사용하여 필라멘트 (1.5 mm 외경 1.12 mm 내경)없이 얇은 벽으로 둘러싸인 붕규산 모세 혈관을 당깁니다.
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결과
우리는 이전에 칼슘 유입이 하나의 셀 (24) 부상 후 나타나는 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 다른 이온 플럭스는 단일 세포 상처에 발생 여부를 물었다. 우리는 X를 사용 난자, 단일 셀 상처 치유 30-34과 전기 생리 기록 24,35-39에 대한 잘 확립 된 모델을 laevis의. 흥미롭게도, 칼륨 이온은 X. 내부 더 농축하여 laevis의 것은 난자 (약 110 mM)을 (MMR 1 배에서 1 mM)을 사용하는 세포 외 용액에서 40 상처에 따라 칼륨의 유출을 시사한다. 상기 가정을 확인하기 위해, 우리는 X. 과정 중에 칼륨 플럭스를 측정 이온 선택 자체 참조 미세 전극을 이용하여 난자 세포막 laevis의 치유.
난자 상처하려면 먼저 큰 팁 크기 (~ 50 μm의)와 모세관 전극을 당깁니.......
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토론
생체 내에서 세포 외 이온 플럭스의 성공적인 측정을위한 가장 중요한 단계는 : 소음의 감소, 이온 선택성 미소 전극과 기준 전극의 정확한 제조 한 샘플과 두 전극의 위치.
잡음을 최소화하기 위해, 기록 방식이 바람직 또한 접지되어 금속 얹어 (제진) 테이블과 접지 된 패러데이에 있어야한다. 또한, 현미경 섀시는 또한 접지되어야한다. 전기 노이즈의 소스는 광원을 포함한다. 광섬유 '팬이없는'광원은 최소한의 전기적인 노이즈가 발생합니다. 마지막으로, 소유자는 염화물 미세에 실버 와이어와 펠렛을 유지하는 (차아 염소산 나트륨 표백제에 딥과 DH 2 O에 린스)를 사용하여 소음을 최소화 이온 선택적 미세 또는 측정 될 것이다 기준 전극에 공기 방울의 국지적 인 존재 같은 실패미세 전극의 전도성은 존재하지 않거나 손상 될 것입니다. 따라서, 홀더에 장착하기 전에이를 현미경으로 전극을 확인하는 것이 중요하다. 공기 방울을 제거하기위한 세.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 National Science Foundation 보조금 MCB-0951199, NIH 보조금 EY01910, California Institute of Regenerative Medicine 보조금 RB1-01417 및 Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) 보조금 SFRH/BD/87256/2012의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아이오앰프 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | 미국 | 매사추세츠주 우즈 홀에 있는 BioCurrents Research Center에서 만든 증폭기 없음; 유사한 시스템은 "에서 구입할 수 있습니다. XBL 기능이 중요합니다." (http://www.xuyue.org/) 또는 " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) 또는 해당 전자 제품(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA에서 만든 소프트웨어 없음; 유사한 시스템은 "에서 구입할 수 있습니다. XBL 기능이 중요합니다." (http://www.xuyue.org/) 또는 " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) 또는 해당 전자 제품(http://www.applicableelectronics.com/) | |
| 헤드 스테이지 프리 앰프 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR 전압 팔로워 INA116, BioCurrents Research Center에서 설계, Woods Hole, MA, USA; 유사한 시스템은 "에서 구입할 수 있습니다. XBL 기능이 중요합니다." (http://www.xuyue.org/) 또는 " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) 또는 해당 전자 제품(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep 드라이버 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | X | , Y 및 Z 포지셔닝에는 3개의 MicroStep 드라이버가 필요하지 않습니다. BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA에서 제작했습니다. 유사한 시스템은 "에서 구입할 수 있습니다. XBL 기능이 중요합니다." (http://www.xuyue.org/) 또는 " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) 또는 적용 가능한 전자 제품(http://www.applicableelectronics.com/) |
| 수동 마이크로 포지셔너 | 세계 정밀 기기 | 모델 KITE-R | 유사한 시스템은 적용 가능한 전자제품(http://www.applicableelectronics.com/)마그네틱 스탠드에서 구매할 수 있습니다 |
| World Precision Instruments | 모델 M10 | 유사한 시스템은 Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)진동 절연 표에서 구입할 수 있습니다 | |
| . | 뉴포트 Inc. | 모델 VW-3036-OPT-023040 | 유사한 시스템은 적용 가능한 전자제품(http://www.applicableelectronics.com/)에서 구매할 수 있습니다. |
| 가지 차원의 마이크로포지셔너의 일부입니다: 꺾쇠 괄호, 90도;, 슬롯형 면 | Newport Inc. | 모델 360-90 | 세 개의 dimantionnal micropositionner의 집합체는 또한 X, Y, Z 제어를 위한 세 개의 전기 회전 모터, MCA-2 조절 가능한 각도 포스트가 있는 MPH-1 마운팅 암, 그리고 다양한 Newport 커넥터와 진동 테이블에 볼트로 고정하는 나사가 필요합니다 |
| 세 가지 차원의 micropositioner의 일부: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | 없음 |
| 3차원 마이크로포지셔너의 일부: 퀵 마운트 리니어 스테이지, 0.5인치 XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | 없음 |
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| 아가 로즈 | 시그마 - 알드리치 | A9539 | 없음 |
참고문헌
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122
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