חומוס לב הפלישה Assay עבור בדיקת הפולשנות של תאי סרטן והפעילות של תרכובות פוטנציאלית אנטי-פולשנית
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את הפלישה של תאי גידול לחיים שברי רקמה נורמלים בשלושה ממדים. טכניקת תרבות איבר זה מיושמת בעיקר כדי לבדוק את התרופות שעלולים להיות אנטי-פולשני במבחנה.
Abstract
המטרה של assay לב החומוס היא להציע שיטת תרבות איבר רלוונטית ללמוד פלישת גידול בשלושה ממדים. Assay יכול להבחין בין תאים פולשניים ולא פולשנית, ומאפשר לימוד ההשפעות של תרכובות בדיקה בפלישת גידול. תאים סרטניים – אם כאגרגטים או תאים בודדים – מתמודדים עם שברי לב חומוס עוברי. אחרי תרבות איבר בהשעיה לכמה ימים או שבועות תרבויות התמודדות קבועות ומשובצות בפרפין לניתוח היסטולוגית. האינטראקציה תלת-ממדית בין תאי הסרטן והרקמות נורמליות אז שיחזרה מסעיפי סדרתי מוכתמים hematoxylin-eosin או לאחר מכתים immunohistochemical לאפיטופים ברקמת הלב או תאי סרטן ההתמודדות. Assay עולה בקנה אחד עם התפיסה האחרונה שפלישת הסרטן היא התוצאה של אינטראקציות מולקולריות בין תאי הסרטן ואלמנטי מארח סטרומה השכנה (myofibroblasts, endothתאי elial, רכיבי מטריצה תאיים, וכו '). כאן, סביבת סטרומה זה מוצעת לתאי הסרטן שבר רקמת חיה. היבטי תמיכה לרלוונטיות של assay הם מרובים. פלישה בassay היא בהתאם לקריטריונים של פלישת סרטן: הכיבוש מתקדם והחלפה בזמן ובמרחב של רקמת המארח, והפולשנות ולא הפולשנות vivo של התאים מתעמתים בדרך כלל בקורלציה עם התוצאה של assay. יתר על כן, דפוס הפלישה של תאים בגוף חי, כהגדרתו על ידי פתולוגים, בא לידי ביטוי בתמונות היסטולוגית בassay. ניתוח הכמותי ביחס מבנה-פעילות (QSAR) של התוצאות שהושגו עם תרכובות אורגניות שעלולים להיות אנטי-פולשני רבות משלימה אפשר המחקר של יחסי מבנה-פעילות לפלבנואידים וchalcones, ותרופות אנטי-גרורתי ידועה בשימוש בקליניקה (למשל, מעכבי microtubule ) לעכב פלישה בassay גם כן. However, assay אינו לוקח בחשבון תרומות חיסוניות לפלישת הסרטן.
Introduction
פלישה היא סימן ההיכר של גידולים ממאירים. פעילות זו מובילה לא רק להרס של רקמות הסובבות, אלא גם מעורב בהיווצרות גרורה. מאז חולי הסרטן מתים מפלישה וגרורות, וטיפולים אנטי-פולשני יעילים עדיין מבחני המחקים את הפלישה של תאים סרטניים פותחו נדירים, מעבדה. המטרה של assay לב החומוס היא להציע שיטת תרבות איבר רלוונטית ללמוד פלישת גידול בשלושה ממדים. Assay יכול להבחין בין תאים פולשניים ולא פולשנית, ומאפשר ללמוד את ההשפעות של תרכובות בדיקה בפלישת גידול.
הרציונל מאחורי השימוש של assay הוא המושג הממשי שגידולים הם מערכות אקולוגיות שבו תאי neoplastic רציפות אינטראקציה עם סטרומה (תאי מארח ומטריקס), וכי באמצעות פלישת אינטראקציות המולקולרית אלה הוא 1 מכויל. אז, בassay תאי גידול מתמודדים עם ליווישברי ng עובריים לב חומוס 2, המשמשים לא רק כמצעים לפלישה על ידי התאים הסרטניים, אלא גם כמקור של סוגים שונים של תאי סטרומה ואלמנטי מטריצה של. לב החומוס מכיל myocytes, fibroblasts ותאי האנדותל, ומטריקס מורכב מlaminin, פיברונקטין וסוגים שונים של קולגן. בדרך זו, טכניקת תרבות איבר תלת ממדים מכסה אינטראקציות תאיות ומולקולריות רבות מעורבות בפלישה של גידולי מטופל.
היתרון העיקרי של assay לב החומוס הוא יישום אפקטי סטרומה. היבט זה הוא יותר מלא מאשר במבחני פלישה אחרים במבחנה המבוססים על פלישת תאים סרטנית לג'לי שאינו חי המורכב ממרתף קרום 3 או מטריצת ביניים 4 מולקולות. הרעיון של עימות בין תאי גידול ורקמות מארח חיים נורמלים כפי שנמצא בניסויים תרבות איבר כבר הציג בכמהמחברים כוללים וולף ושניידר בצרפת 5, Easty וEasty בבריטניה 6, וSchleich בגרמניה 7. שני יתרונות טכניים של assay פלישת לב חומוס על השיטות שהובאו הוא שהנפח של שברים יכול בקלות להיות סטנדרטי, ושהם יישארו התכווצות, המאפשרת ניטור שלמות פונקציונלי בתרבות איבר. יתר על כן, עוברי עופות עדיפים, כי הם יכולים בקלות להיות גזור מתוכן סטרילי של הביצה. יש דמיון רעיוני לassay assay קרום chorioallantois החומוס 8 על ידי הצעת סטרומה מורכבת המקיפה את תאי גידול.
Assay בהצלחה יושם להבחין בין גרסאות תא פולשנית ובלתי פולשני מאותה גידולים אנושיים כגון בMCF-7 (החלב) 9 וHCT-8 (מעי הגס) 10 משפחות שורת תאים. הטכניקה זו שימושית כדי לבדוק תרכובות פוטנציאל אנטי-פולשני כמו גם <sup> 11,12. כפי שהוסבר נוסף, ניתן להשתמש בו לכינון יחסי מבנה-פעילות של מולקולות אורגניות קטנות. Assay אין, לעומת זאת, לא לוקח בחשבון את תרומתם של תאים חיסוניים לפלישת הסרטן. יודגש כי הטכניקה אינה יכולה להיחשב כמערכת ניתוח תפוקה גבוהה, בגלל המספר הגבוה של מניפולציות, (כחודש 1) מספר המוגבל של ריצות assay (30 תרבויות המרביות) וזמן סיבוב סביב הארוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך תקופת ההכנה של PHFs, שברים לא יכולים להישאר בהשעיה אלא לדבוק בקיר הכלי; זה ניתן להתגבר על ידי הגדלת נפח בינוני התרבות. אם מספר PHFs הוא נמוך מדי והגודל שלהם הוא גדול מדי, להחליש את עוצמת הקול של מדיום התרבות. כישלון של תאי הבדיקה כדי לצבור יכול להיות בגלל תנודות בטמפר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).
Materials
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P., JR, B. e. r. t. i. n. o. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. 2, 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J., MB, V. i. s. s. e. r. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. 2, 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A., Grundmann, E. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. , 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
