Чик Сердце Вторжение Пробирной для тестирования инвазивность раковых клеток и активность потенциально антиинвазивный соединений
Summary
Здесь мы приводим протокол для изучения вторжение опухолевых клеток в живых нормальных фрагментов тканей в трех измерениях. Эта техника орган культура в основном применяется для тестирования потенциально анти-инвазивных наркотиков в пробирке.
Abstract
Цель цыпленок сердца анализа является предложить соответствующий метод органной культуре для изучения опухолевой инвазии в трех измерениях. Анализ может различать инвазивных и неинвазивных клеток, и позволяет изучение влияния тестируемых соединений на инвазии опухоли. Раковые клетки – либо в виде агрегатов или отдельных клеток – столкнулись с фрагментами эмбрионального куриного сердца. После органной культуры в суспензии в течение нескольких дней или недель противоборствующие культуры фиксированной и заливали в парафин для гистологического анализа. Трехмерная взаимодействие между раковыми клетками и нормальной ткани затем восстановлены из последовательных срезах, окрашенных гематоксилин-эозином или после иммуногистохимического окрашивания для эпитопов в сердечной ткани или противоборствующих раковых клеток. Анализ согласуется с новой концепцией, что вторжение рак результат молекулярных взаимодействий между раковыми клетками и их элементов принимающих соседних стромы (Миофибробласты, endothelial клетки, компоненты внеклеточного матрикса и т.д.). Вот, это стромальных среда предлагается раковых клеток как фрагмент живой ткани. Поддержка аспекты актуальности анализа являются несколько. Вторжение в анализе в соответствии с критериями вторжения рака: прогрессивная оккупации и запасных во времени и пространстве ткани хозяина, и инвазивности и не инвазивности в естественных условиях из стоящих клеток, как правило, коррелирует с результатами анализа. Кроме того, вторжение образец клеток в живом организме, как это определено патологи, отражается в гистологических изображений в анализе. Количественный структура-активность соотношение (КЗСА) анализ полученных результатов с многочисленными потенциально анти-инвазивных органических соединений этой соединений позволило изучение структура-активность отношений для флавоноидов и халконов и известных антиметастатическую препаратов, используемых в клинике (например, ингибиторы микротрубочек ) ингибировать инвазию в анализе, а также. Howeveг, проба не учитывать иммунологических взносов вторжения рака.
Introduction
Вторжение признаком злокачественных опухолей. Эта активность приводит не только к разрушению окружающих тканей, но также участвует в формировании метастазов. Так как пациенты рака умирают от инвазии и метастазированию, и эффективных анти-инвазивных методов лечения по-прежнему мало, лабораторные анализы, которые имитируют были разработаны вторжение опухолевых клеток. Цель цыпленок сердца анализа является предложить соответствующий метод органной культуре для изучения опухолевой инвазии в трех измерениях. Анализ может различать инвазивных и неинвазивных клеток, и позволяет изучить влияние исследуемых соединений на опухолевой инвазии.
Обоснованием использования анализа является само понятие, что опухоли экосистемы, где опухолевые клетки постоянно взаимодействуют с их стромы (клеток-хозяев и внеклеточной матрицы), и что через эти молекулярные взаимодействия вторжение доработаны 1. Так, в тесте опухолевые клетки сталкиваются с Ливиэмбриональные нг фрагменты куриных сердца 2, которые служат не только в качестве подложек для вторжения опухолевыми клетками, но и в качестве источника различных типов стромальных клеток и матричных элементов. Куриных сердца содержит миоциты, фибробласты и эндотелиальные клетки, а внеклеточный матрикс состоит из ламинин, фибронектин и различные виды коллагена. Таким образом, трехмерная техника орган культура охватывает многие клеточные и молекулярные взаимодействия, замешанных в вторжения опухолей пациентов.
Основным преимуществом куриного сердца анализе является реализация стромальных эффектов. Этот аспект является более полной, чем в других анализах вторжения в пробирке, которые основаны на опухолевой инвазии клеток в гели неживых, состоящих из базальной мембраны 3 или 4 интерстициальной матрице молекул. Концепция конфронтации между опухолевыми клетками и нормальной тканью хозяина гостиной, как найти в органной культуры экспериментов была введена несколькоАвторы включая Вольф Шнайдер и во Франции, 5 Исти и Исти в Великобритании 6 и Schleich в Германии 7. Два технические преимущества куриных сердца вторжения анализа в течение указанных методов является то, что объем фрагментов может легко быть стандартизированы, и что они остаются сократительной, которая позволяет функциональный контроль целостности во органной культуре. Кроме того, предпочтительными являются эмбрионов птиц, потому что они легко могут быть расчленены из стерильной содержания яйца. Анализ имеет концептуальную сходство с куриных хориоаллантоисе мембраны анализа 8, предлагая комплексное стромальные окружающую к опухолевым клеткам.
Анализ был успешно применен для различения инвазивных и неинвазивных вариантов клеток из тех же опухолей человека, например, в клетках линии MCF-7 (молочной) 9 и HCT-8 (ободочной) 10 семейств клеточных линий. Метод полезен для тестирования потенциально анти-инвазивных соединений, а также <suр> 11,12. Как далее объяснено, он может быть использован для создания структура-активность отношений малых органических молекул. Анализ, однако, не принимать во внимание вклад иммунологических клеток к инвазии рака. Следует подчеркнуть, что техника не может рассматриваться в качестве системы анализа с высокой пропускной, из-за большого количества манипуляций, то ограниченное количество аналитических прогонов (максимум 30 культур) и длинная очередь вокруг времени (около 1 месяца).
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время подготовки пневмо-гидравлическая система подачи, фрагменты не могут остаться в суспензии, но придерживаться стенки сосуда; это может быть преодолена путем увеличения объема культуральной среды. Если число пневмо-гидравлическая система подачи слишком низка, а их размер слишк?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).
Materials
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P., JR, B. e. r. t. i. n. o. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. 2, 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J., MB, V. i. s. s. e. r. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. 2, 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A., Grundmann, E. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. , 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
