Chick Heart Invasion analys för Testa Invasivitet av cancerceller och aktiviteten av potentiellt Anti-invasiva Föreningar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att studera invasion av tumörceller i levande normala vävnadsfragment i tre dimensioner. Detta organ odlingsteknik tillämpas huvudsakligen för att testa potentiellt anti-invasiva läkemedel in vitro.
Abstract
Målet med kycklinghjärt analys är att erbjuda en relevant organkultur metod för att studera tumörinvasion i tre dimensioner. Analysen kan skilja mellan invasiva och icke-invasiva celler, och möjliggör studier av effekterna av testföreningarna på tumörinvasion. Cancerceller – antingen som aggregat eller enstaka celler – konfronteras med fragment av embryonala chick hjärta. Efter organkultur i suspension under några dagar eller veckor de konfronterande odlingarna fixerades och inbäddades i paraffin för histologisk analys. Det tredimensionella interaktion mellan cancerceller och den normala vävnaden därefter rekonstrueras från seriella sektioner färgade med hematoxylin-eosin eller efter immunohistokemisk färgning för epitoper i hjärtvävnaden eller de konfronterande cancerceller. Analysen är i linje med den senaste konceptet att cancerinvasion är resultatet av molekylära interaktioner mellan cancerceller och deras angränsande stromala värdelement (myofibroblaster, endothelial celler, extracellulära matriskomponenter, etc.). Här är detta stromal miljö erbjuds till cancerceller som en levande vävnad fragment. Stöd aspekter relevansen av analysen är flera. Invasion i analysen är i enlighet med kriterierna i cancerinvasion: progressiv ockupation och utbyte i god tid och utrymme för värdvävnaden, och invasiv och icke-invasiv in vivo av de motstående celler i allmänhet korrelerar med resultatet av analysen. Vidare, invasionen mönster av celler in vivo, såsom definieras av patologer, återspeglas i de histologiska bilder i analysen. Kvantitativa struktur-aktivitets förhållande (QSAR) analys av de resultat som erhölls med många potentiellt anti invasiva organiska kongen föreningar tillät studier av struktur-aktivitetssamband för flavonoider och chalkoner, och kända antimetastatiska läkemedel som används i kliniken (t.ex. mikrotubuli-inhibitorer ) inhiberar invasionen i analysen samt. However, inte analysen inte hänsyn till immunologiska bidrag till cancerinvasion.
Introduction
Invasion är ett kännetecken för maligna tumörer. Denna aktivitet inte bara leder till förstörelse av omgivande vävnader, utan är också inblandat i metastasbildning. Eftersom cancerpatienter dör av invasion och metastas, och effektiva anti-invasiva behandlingar är fortfarande sällsynta, laboratorieanalyser som efterliknar invasionen av tumörceller har utvecklats. Målet med kycklinghjärt analys är att erbjuda en relevant organkultur metod för att studera tumörinvasion i tre dimensioner. Analysen kan skilja mellan invasiva och icke-invasiva celler, och gör det möjligt att studera effekterna av testföreningarna på tumörinvasion.
Logiken bakom användningen av analysen är själva begreppet att tumörer är ekosystem där de neoplastiska cellerna samverkar kontinuerligt med sin stroma (värdceller och extracellulära matrix), och att genom dessa molekylära interaktioner invasion är finjusteras 1. Så, i analysen tumörceller konfronteras med living embryonala kycklinghjärtfragment 2, som tjänar inte bara som substrat för en invasion från tumörcellerna, utan också som en källa för olika typer av stromala celler och matriselement. Ungen hjärta innehåller myocyter, fibroblaster och endotelceller, och den extracellulära matrisen är sammansatt av laminin, fibronektin och olika typer av kollagen. På detta sätt täcker den tredimensionella organkultur teknik många cellulära och molekylära interaktioner som är inblandade i invasion av patientens tumörer.
Den huvudsakliga fördelen med kycklinghjärt analysen är genomförandet av stromala effekter. Denna aspekt är mer komplett än i andra invasionsanalyser in vitro som bygger på tumörcellinvasion till icke-levande geler bestående av basalmembran 3 eller interstitiell matris 4 molekyler. Begreppet konfrontation mellan tumörceller och normala levande värdvävnad som återfinns i organkultur experiment har införts av fleraFörfattarna inklusive Wolff och Schneider i Frankrike 5, Easty och Easty i Storbritannien 6 och Schleich i Tyskland 7. Två tekniska fördelarna med kyckling hjärtat invasionen analys över de angivna metoderna är att volymen av fragmenten enkelt kan vara standardiserade och att de förblir sammandragande, vilket möjliggör funktionella integritet övervakning under organkultur. Vidare är fågelembryon föredrages, eftersom de lätt kan skäras ut från den sterila innehållet av ägget. Analysen har begreppsmässiga likheter med kyckling chorioallantois membrananalys 8, genom att erbjuda en komplex stromal omgivande till tumörcellerna.
Analysen har framgångsrikt tillämpats för att skilja mellan invasiva och icke-invasiva cellvarianter från samma humana tumörer såsom i MCF-7 (bröst) 9 och HCT-8 (kolon) 10 cellinje familjer. Tekniken är användbar för att testa potentiellt anti invasiva föreningar samt <sup> 11,12. Såsom förklaras ytterligare, kan det användas för fastställande av struktur-aktivitetsrelationer av små organiska molekyler. Analysen har dock inte ta hänsyn till bidraget av immunologiska celler till cancerinvasion. Det bör betonas att tekniken inte kan betraktas som en hög genomströmning analyssystem, på grund av det stora antalet manipulationer, de begränsade antalet analyskörningar (högst 30 kulturer) och den långa vändning tid (cirka 1 månad).
Protocol
Representative Results
Discussion
Under förberedelserna av PHF kan fragmenten inte stanna i suspension men hålla sig till kärlväggen; detta kan övervinnas genom att öka volymen av odlingsmediet. Om antalet PHF är för låg och deras storlek är för stor, minska volymen av odlingsmediet. Fel i testcellerna att aggregera kan bero på variationer i temperatur eller till mikrobiell infektion. Alternativt kan en oförmåga att aggregera vara en inneboende egenskap hos cellerna. Under fastsättningen av aggregaten till PHF, kan dålig vidhäftning öv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).
Materials
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P., JR, B. e. r. t. i. n. o. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. 2, 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J., MB, V. i. s. s. e. r. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. 2, 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A., Grundmann, E. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. , 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
