조직 학적 분석을위한 근육 저온부의 준비의 것과하지 말아야을 수행

Summary

여기에서는 인공물 동결을 피하기 위해 근육 생검을 동결, 포매팅, 동결 절제 및 염색하는 가장 효율적인 방법을 보여줍니다.

Abstract

근육 생검의 조직 학적 평가는 신경 근육 질환의 병리의 개발 및 진행의​​ 이해에 필수적인 도구 역임했다. 그러나, 이렇게하기 위해, 적절한 치료는 절제 최적 염색을 달성하기 위해 조직을 보존 할 때 수행되어야한다. 조직 보존의 한 방법은 파라핀 왁스를 삽입 한 후 포름 알데히드의 조직을 고정하고 포함한다. 이 방법은 잘 형태를 유지하고 실온에서 장기간 보관이 가능하지만, 복잡하고 독성 화학 물질의 취급을 요구한다. 또한, 효과적인 면역 항원에 대한 검색 프로토콜을 필요 항원 가교, 포름 알데히드 고정 결과. 반대로, 동결 절편은 고정을 필요로하며, 따라서 생물 항원 형태를 유지하지 않는다. 이 방법은 intraopera 같은 빠른 조직 학적 평가를 필요로하는 상황에서이 특히 유용하고, 시간의 주위에 빠른 차례에 뚜렷한 장점을 제공합니다수술 적 생검을 포지티브,. 여기에서 우리는 다른 조직 학적 및 면역 학적 얼룩과 시각화를위한 근육 조직 검사를 준비하는 가장 효과적인 방법을 설명합니다.

Introduction

근육 조직 학적 검사는 신경근 장애 ^1-4의 다른 유형의 이해에 중요한 역할을한다. 다른 기술과 결합 할 때, 연구자들은 병리의 증상과 진행의 더 나은 아이디어를 얻을 수 있고 치료 적 개입 ^5-10의 효능을 평가하는 것이 필수적이 될 수 있습니다. 절단 직전의 생리 상태를 유지하도록하지만 정확한 것으로, 조직을 적절한 방식으로 유지 될 필요가있다. 이것은 제거, 보존, 절편 및 염색시 세심한주의가 필요합니다.

조직은 광학 현미경 연구를위한 두 가지 방법으로 제조 될 수있다. (FFPE) 섹션, 포함 된 첫 번째 방법, 포르말린 고정 파라핀 조직을 파라핀 왁스 ^{(11, 12)에} 포함되기 전에 10 % 자연 버퍼 포름 알데히드에 고정해야합니다. 정착 단계는 또한 크로스 링크 내인성 PR 나은 형태를 유지하는 데 도움oteins 따라서 면역 항원에 대한 복잡한 검색 절차를 필요로하며 ¹² 절에 효소 염색 가능성을 제거. 냉동 된 부분은, 다른 한편으로는, 미리 고정 된 또는 처리 될 필요가 없다; 따라서, 단백질은 고유 생물 입체 ^{(13, 14)을} 보유 할 수 있습니다. 또한, 동결 절편은 또한 때때로 육종 및 기타 외과 생검 ^(15)의....

Protocol

1. 조직 수확 및 근육 조직의 동결

1. 이소 플루 란 (2- 클로로 -2- (다이 플루오 로메 톡시) -1,1,1- 트리 플루오로 에탄)의 과다와 마우스를 안락사. 흄 후드에서이 단계를 수행 및 건조기 또는 이소 플루 란에 적신 면봉을 포함하는 벨 항아리로 보조 봉쇄 방법을 사용합니다.
2. 단단히 발바닥을 압박하여 죽음을 확인합니다. 이러한 자궁 전위로 안락사의 보조 방법을 사용합니다.
3. 근육에 느슨한 머리카락의 부착을 감소시키기 위해 70 % 알코올로 모피 젖은. 같은 # 5로 미세 집게를 사용하여 사지 떨어져 피부 껍질.
4. 조심스럽게 아래 뼈 (이 경우에는 전 경골근 (TA)) 관심의 근육을 분리 건에서 시작하여 제거합니다.
5. 근육을 절제 10월 (최적 절단 온도 화합물)에 커버 및 라벨 일회용 동결 금형 위에 올려 놓습니다. 근육이 타이에 정상적인 생리적 방향 (머리에 있는지 확인스트레칭없이 L). 대안 적으로, 작은 스티로폼 사각형에 근육을 동결 및 근육의 정확한 길이를 보장하는 곤충 핀을 사용하여 고정.
6. 액체 질소를 사용하여 강철 비이커 중 2- 메틸 부탄 (이소 펜탄)을 진정. 5 분 -이 평균 3 일이 걸립니다. 흰색 침전물이 비커의 바닥과 벽에 형성하기 시작할 때까지 간헐적으로 ....

Results

수확 및 조직의 동결을위한 셋업은 그림 1에서 볼 수 있습니다. 절제된 조직은 건조 (그림 1A)를 방지하기 위해 PBS에 적신 거즈에 저장해야합니다. 조직들은 정확한 형태 (도 1b)을 보장하기 위해 OCT에서 침지 크라이 금형에 뻗어 올바른 방향으로 가능한 생리적 길이에 가까워 야 학적 해석에 사용하기 위해 선택되는 경우. 동결 조직 적합 펜탄 슬러리는 액체 질소로 냉각하고 이소 펜탄 작은 백색 침전물이 나타날 때까지 바닥에서 교반에 의해 달성 될 수있다. 이 시점에서, 매체는 (도 1C)를 냉동실에 적합하다. 조직은 조직 (그림 1D)의 크기 / 두께에 따라 냉장 이소 펜탄에 6-15 초에서 동결해야합니다. 동결 후, 근육 -80 <이 드라이 아이스에 저장해야 지적하는 백악질 흰색을 표시하고 나중에 전송합니다강한> ° C의 냉동고.

Discussion

조직학 및 면역 조직 화학 다양한 신경 근육 질환의 증상과 병변의 진행을 이해하기위한 주요 도구로 사용되어왔다. 클래식, 근육 생검 먼저 포름 알데히드에 고정 후 파라핀 왁스 내장했다. 포름 알데히드는 고정 조직 구조를 보존하고 RT에서 티슈 저장 및 전송을 허용하지만, 또한 정확한 면역을 달성하기 위해 추가의 단계를 필요로 가교 효소와 단백질을 비활성화한다. 이 문제는 고정 된 섹션을 이용하여 제거되지만,이 방법은 최적의 염색 결과와 정확한 해석 ^{14,15 구해진} 고유 한 기술적 과제를 제시한다.

첫째,이자가 분해 및 분해가 몸에서 제거 후 곧 시작으로 샘플이 수술 절제 후 즉시 동결하는 것이 필수적이다. 또한 조직의 크기에 따라 변화 시간의 적당한 시간 동안 급속 냉동하고 철저해야/ 조직의 두께. 이 제대로 수행되지 않는 경우, 조직 학적 평가를 위해 쓸모 렌더링 조직 손상 발생을 동결. 동결에 따라, 조직은 즉시 절편 때까지 매우 낮은 온도 (-80 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
저온 유지 장치	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., 사무실 전화 1-800-248-0123 대안: Richard Allen Scientific
현미경	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., 전화: 1-631-547-8500 대안: 올림푸스
이미지 분석 소프트웨어	니콘 이미징 소프트웨어 기초 연구	니콘 인스트루먼트 Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., 전화: 1-631-547-8500 대안: 이미지 J, 변형
이소플루란	14043-220-05	JD 메디컬 디스트 주식회사	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 미국
OCT	4583	사쿠라 Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. 대체 출처: Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
일회용 조직 금형	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
Colorfrost plus 슬라이드	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
에틸 알코올	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific