Rose Bengal Photothrombosis door confocale Optical Imaging<em> In Vivo</em>: Een model van de Single Vessel Stroke

Summary

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

De techniek beschreven vergunningen visualisatie van in vivo cellulaire reacties onmiddellijk na inductie van Rose Bengal photothrombosis in een intacte muis. Rose Bengal (4,5,6,7-tetrachloor-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) een fotogevoelige gebruikt om ischemische beroerte in diermodellen (muis en rat) induceren. Na een bolus injectie van RB door de staartader en de daaropvolgende verlichting door middel van een uitgedund schedel met een 564 nm laserlicht, is een trombus inductiestroom het veroorzaken van een fysiologische slag ^1. De methode werd oorspronkelijk beschreven door Rosenblum en El-Sabban in 1977, en werd later aangepast door Watson in het midden van de jaren 1980 ^1,2. In het kort, wordt Rose Bengal bestraald met groene excitatielicht (561 nm laser in ons geval), die de productie van reactieve zuurstof species, die vervolgens activeert weefselfactor, een initiator van de stollingscascade gegenereerd. De inductie van de stollingscascade produceert een ischemisch lesion dat pathologisch relevant klinische beroerte ^3.

Beroerte heeft een complexe pathofysiologie gevolg van de invloed van vele verschillende celtypen waaronder neuronen, glia, endotheel en het immuunsysteem. Het kiezen van de beste techniek te bestuderen van een bepaald cellulair proces vereist meerdere overwegingen. Experimentele technieken vallen ruwweg in drie categorieën: in vitro, in vivo en in silico met elk voor- en nadelen In vitro studies hebben de primaire nadeel van het verwijderen van cellen uit hun natuurlijke omgeving en daarom mag geen effecten gezien in een intacte reproduceren. levend dier. In vivo technieken zorgen voor een verbeterde experimentele replicatie van ziektebeelden met een verhoogde translatie betekenis. In silico algemeen verwijst naar computermodellen van een ziekte of een cellulair proces, en terwijl in toenemende mate gebruikt om mogelijke interacties tussen geneesmiddelen voor examen studerenple, alle informatie die verkregen moet nog getest worden in levende cellen of weefsels.

Het ideale model van een beroerte in het laboratorium instelling moet aantonen vergelijkbaar pathologische kenmerken met die in de menselijke populatie. Hoewel er gemeenschappelijke fysiologische kenmerken van een beroerte in de humane populatie, zijn er ook veel verschillen afhankelijk van het type schade voor. Stroke in de humane populatie voorkomt als klein of groot vat occlusies, hemorrhagische laesies en slagader te slagader of cardio-embolieën die resulteren in verschillende infarct volumes en de verschillen in mechanismen die verantwoordelijk elke pathologie. Het voordeel van het gebruik van dierlijke tweetaktmodellen is het genereren van reproduceerbare infarcten die karakteristieken van menselijke beroerte nabootsen. De meest voorkomende dier beroerte modellen omvatten slagader occlusie met: midden cerebrale slagader occlusie (embolische of endovasculaire filament methoden), die modellen distale MCAO en de photothrombosis model. De voordelen van eend nadelen van elk model zijn elders beoordeeld (zie ⁴ en ^5). Global ischemische modellen (MCAO), terwijl het relatief eenvoudig uit te voeren zijn minder relevant voor de menselijke beroerte dan zijn brandpunt takt modellen. Bovendien zijn deze werkwijzen zeer variabel in induceren reproduceerbare herseninfarct laesies. Het photothrombosis model is zeer reproduceerbaar zolang de experimentator regelt hun experimenten goed, een duidelijk voordeel ten opzichte MCAO modellen. Vanwege microvasculatuur insult model is beschreven een minimale ischemische penumbra, het gebied waar de cellen worden verondersteld redden ^6,7 te geven. Bovendien kunnen vasogeen oedeem en cytotoxische oedeemvorming worden geïnduceerd na bestraling van het beeldgebied. Ondanks deze beperkingen techniek nieuwe inzichten voorziet in vele fysiologische processen na beroerte ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Opmerking: Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio en waren in overeenstemming met de richtlijnen KOMEN. 1. verlamming voor Cortical Voorbereiding Plaats de muis in een inductie kamer met 2-3% isofluorane gemengd met zuurstof om anesthesie. Let op de ademhaling daling als de muis wordt geïnduceerd. Knijp de poot van de muis te bepalen of de muis is klaar om …

Representative Results

Het doel van deze werkwijze was een ischemische beroerte in diermodellen (muis en rat) na een bolus injectie van RB met de staartader en daaropvolgende belichting van een schedel verdund met 561 nm laserlicht induceren. De afbeeldingen in figuur 4 tonen de voortgang van stolselvorming in een enkel vat na bestraling van het gebied van 0, 1, 1,5 en 2 minuten. Voorafgaand aan de vorming van een stolsel het hele schip is wit te wijten aan vrij stromende Rose Bengal. Na de inductie van bestraling van het vat…

Discussion

De mogelijkheid om experimentele beroerte pathofysiologie vertalen van dier op mens applicatie is geplaagd door mislukking. Het gebruik van diermodellen, zoals photothrombosis model zorgt voor beter begrip van beroerte pathofysiologie en de exploratie van nieuwe therapeutische benaderingen voor neurobescherming na een beroerte. Kleine corticale beroertes en microinfarctions door de fototrombotisch model is klinisch relevant subklinische of "stille" stroke ^13-15, die een hoge prevalentie en treft ong…

Materials

			Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
			[header]
			Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53