Rose Bengale Photothrombosis par imagerie optique confocal<em> In Vivo</em>: Un modèle de l'unité des maladies du navire

Summary

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

La technique décrite permet la visualisation de la réponse cellulaire in vivo, immédiatement après l'induction de Rose Bengale photothrombosis dans une souris intactes. Rose Bengale (4,5,6,7-tétrachloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tétraiodofluorescéine) est un colorant photosensible utilisée pour induire un AVC ischémique dans des modèles animaux (souris et le rat). Suite à une injection en bolus de RB par la veine de la queue et l'illumination ultérieure par un crâne amincie avec une lumière laser de 564 nm, un thrombus est induit provoque un accident vasculaire cérébral physiologique ^1. La méthode a été initialement décrit par Rosenblum et El-Sabban, en 1977, et a ensuite été adapté par Watson dans les milieu des années 1980 ^1,2. En bref, le rose Bengale est irradié avec de la lumière verte d'excitation (laser 561 nm dans notre cas), ce qui génère la production d'espèces réactives de l'oxygène, qui active ensuite le facteur tissulaire, un initiateur de la cascade de coagulation. L'induction de la cascade de coagulation produit une ischémie lesion qui est pathologiquement pertinentes pour AVC clinique ^3.

AVC a une physiopathologie complexe en raison de l'interaction de nombreux types de cellules différents, y compris les neurones, les cellules gliales, l'endothélium et le système immunitaire. Le choix de la meilleure technique pour étudier un processus cellulaire particulier nécessite plusieurs considérations. Techniques expérimentales retrouvent globalement dans une des trois catégories: in vitro, in vivo et in silico chacun ayant des avantages et des inconvénients Des études in vitro ont l'inconvénient principal de l'élimination des cellules de leur milieu naturel et peuvent donc ne pas reproduire les effets observés dans une intacte,. animal vivant. Dans les techniques in vivo Pour renforcer la réplication expérimentale d'états pathologiques avec une importance accrue de translation. Dans silico se réfère généralement à la modélisation informatique d'une maladie ou d'un processus cellulaire, et alors que de plus en plus utilisé pour étudier les interactions médicamenteuses potentielles pour examenple, toute information recueillie doit encore être testée dans des cellules ou des tissus vivants.

Le modèle idéal de la course dans le cadre d'un laboratoire doit démontrer les caractéristiques pathologiques similaires à ceux observés dans la population humaine. Bien qu'il existe des caractéristiques physiologiques communes de l'AVC dans la population humaine, il ya aussi beaucoup de différences selon le type de dommage subi. AVC dans la population humaine se produit que de petites ou grandes occlusions des vaisseaux, des lésions hémorragiques, et l'artère à artère ou cardio-embolies qui se traduisent par des volumes d'infarctus variées ainsi que des différences dans les mécanismes liés à chaque pathologie. L'avantage de l'utilisation de modèles de course des animaux est la génération des infarctus reproductibles qui imitent les caractéristiques d'un AVC humaine. Les modèles les plus courants de course d'origine animale comprennent occlusion de l'artère en utilisant: occlusion de l'artère cérébrale moyenne (méthodes de filaments ou emboliques endovasculaires) qui distale MCAO modèles et le modèle de photothrombosis. Les avantages d'uninconvénients de chaque modèle d ont été examinés ailleurs (voir ⁴ et ^5). Les modèles globaux ischémiques (MCAO), tout en étant relativement facile à réaliser sont moins pertinents pour la course humaine que sont les modèles de course focaux. En outre, ces procédés sont très variables dans l'induction de lésions d'infarctus cérébral reproductibles. Le modèle de photothrombosis est hautement reproductible aussi longtemps que l'expérimentateur contrôle leurs expériences bien, offrant un net avantage sur les modèles MCAO. Toutefois, en raison de la microvascularisation insulte le modèle a été décrit pour afficher une pénombre ischémique minimale, la zone où les cellules sont pensés pour être récupérable ^6,7. En outre, l'oedème vasogénique et la formation de l'oedème cytotoxique peut également être induites après irradiation de la zone d'imagerie. Malgré ces limites de la technique a fourni un nouvel aperçu de nombreux processus physiologiques suivants course ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Remarque: Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université du Texas Health Science Center de San Antonio et étaient conformes aux directives arrivent. 1. L'anesthésie pour corticale Préparation Passer la souris dans une chambre d'induction avec 2-3% d'isofluorane mélangé avec l'oxygène pour induire une anesthésie. Observez la diminution du taux de respiration…

Representative Results

Le but de cette méthode est d'induire un AVC ischémique dans des modèles animaux (souris et rats) après une injection en bolus de RB par la veine de la queue et l'illumination subséquente d'un crâne amincie avec une lumière laser de 561 nm. Les images de la figure 4 montrent l'évolution de la formation de caillots à l'intérieur d'une seule cuve après irradiation de la zone à 0, 1, 1,5 et 2 min. Avant la formation de caillots tout le navire est blanche due à écouleme…

Discussion

La capacité à traduire expérimentale course physiopathologie de l'animal à l'application humaine a été en proie à l'échec. Cependant, l'utilisation de modèles animaux, tels que le modèle de photothrombosis, permet d'améliorer la compréhension de la physiopathologie de la course et l'exploration de nouvelles approches thérapeutiques pour fournir une neuroprotection après un AVC. Petits coups et microinfarctions produites par le modèle photothrombotique corticales sont cliniquement p…

Materials

			Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
			[header]
			Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53