רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal<em> In vivo</em>: דגם של שבץ כלי אחד

Summary

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

ההדמיה היתרי הטכניקה המתוארת של in vivo תגובות הסלולר הבאה אינדוקציה של רוז בנגל מייד photothrombosis בעכבר ללא פגע. רוז בנגל (4,5,6,7-tetrachloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) הוא צבע רגיש לשימוש כדי לגרום שבץ איסכמי במודלים של בעלי חיים (עכבר וחולדה). בעקבות הזרקה של RB בולוס דרך וריד הזנב והתאורה שלאחר מכן דרך גולגולת דלילה עם אור לייזר 564 ננומטר, פקיק מושרה גורם שבץ פיסיולוגי ^1. השיטה שתוארה במקור על ידי רוזנבלום ואל-Sabban בשנת 1977, ומאוחר יותר הותאמה על ידי ווטסון באמצע 1980 ^1,2. בקיצור, רוז בנגל הוא מוקרן עם אור ירוק העירור (לייזר 561 ננומטר במקרה שלנו), אשר מייצר את הייצור של מיני חמצן מגיבים, אשר לאחר מכן מפעיל גורם רקמה, יוזם מפל הקרישה. האינדוקציה של מפל הקרישה מייצרת איסכמי lesיון שהוא פתולוגית רלוונטי לשבץ קליני ^3.

יש שבץ הפתופיזיולוגיה מורכבת בשל יחסי הגומלין של סוגי תאים שונים רבים, כולל נוירונים, גליה, האנדותל ואת המערכת החיסונית. בחירת הטכניקה הטובה ביותר ללמוד תהליך סלולארי מסוים מחייב שיקולים רבים. טכניקות ניסיוניות נופלות באופן כללי לאחת משלוש קטגוריות: במבחנה, in vivo ובסיליקון ועם כל יתרונות וחסרונות שיש במבחנה יש חסרון העיקרי של הסרת תאים מהסביבה הטבעית שלהם ולכן לא יכולה להתרבות תופעות ראו בשלמותה,. חיים של בעלי חיים. בvivo טכניקות לספק לשכפול ניסיוני משופר של מדינות מחלה עם משמעות translational גדלה. בסיליקון ובדרך כלל מתייחס למודלים ממוחשבים של מחלה או תהליך סלולארי, ובזמן שמנוצל יותר ויותר ללמוד תגובות בין תרופתיות פוטנציאליות לבחינהple, כל מידע שלוקט חייב עדיין להיבדק בתאים חיים או רקמה.

המודל האידיאלי של שבץ במעבדת ההגדרה צריך להפגין תכונות פתולוגיים דומות לאלה ראו באוכלוסייה האנושית. אמנם יש מאפיינים פיסיולוגיים שכיחים של שבץ באוכלוסייה האנושית, יש גם הבדלים רבים, תלוי בסוג של פציעה חווה. שבץ באוכלוסייה האנושית מתרחש כחסימות קטנות או גדולות ספינה, נגעים מדממים, ועורק לעורק או לב ותסחיפים שיגרמו כרכי אוטם מגוונים כמו גם הבדלים במנגנונים הקשורים לכל פתולוגיה. היתרון של שימוש במודלים של בעלי החיים שבץ הוא הדור של אוטמים לשחזור המחקים מאפיינים של שבץ אדם. דגמי השבץ בבעלי החיים הנפוצים ביותר כוללים חסימת עורק באמצעות: עורקים התיכון ספיגה מוחין (שיטות נימה תסחיפים או endovascular) שMCAO דיסטלי דגמים ומודל photothrombosis. היתרונותחסרונות של כל דגם ד נבדקו במקום אחר (ראה ⁴ ו ^-5). מודלים גלובליים איסכמי (MCAO), בעוד קל יחסית לביצוע הם פחות רלוונטיים לאירוע מוחי אנושי מאשר דגמי שבץ מוקדי. בנוסף, שיטות אלה הן משתנים מאוד בגרימת נגעי אוטם המוח לשחזור. מודל photothrombosis הוא מאוד לשחזור, כל עוד הניסוי שולט ניסויים שלהם גם, מתן יתרון ברור על פני דגמי MCAO. עם זאת, בשל עלבון microvasculature המודל שתואר להציג פנומברה איסכמית מינימאלית, האזור שבו תאים נחשבים להציל ^6,7. בנוסף, בצקת vasogenic והיווצרות בצקת ציטוטוקסיות יכולים גם להיגרם ההקרנה של אזור ההדמיה הבאה. למרות מגבלות אלה הטכניקה סיפקה תובנה חדשה תהליכים פיסיולוגיים רבים לאחר שבץ ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

הערה: נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של האוניברסיטה למדעי בריאות טקסס מרכז סן אנטוניו ועלו בקנה אחד עם ההנחיות להגיע. 1. הרדמה לקליפת מוח הכנה מני?…

Representative Results

מטרתה של שיטה זו הייתה לגרום לשבץ איסכמי במודלים של בעלי חיים (עכבר וחולדה) הבאים הזרקה של RB בולוס דרך וריד הזנב והתאורה הבאה של גולגולת דלילה עם אור לייזר 561 ננומטר. התמונות באיור 4 מדגימות את ההתקדמות של היווצרות קריש דם בתוך כלי אחד לאחר הקרנה של האזור בדקות…

Discussion

היכולת לתרגם הפתופיזיולוגיה שבץ ניסיונית מבעלי חיים לבני אדם יישום כבר נגועה בכישלון. עם זאת, השימוש במודלים של בעלי חיים, כגון מודל photothrombosis, מאפשר להבנה משופרת של הפתופיזיולוגיה שבץ וחקר גישות טיפוליות חדשות כדי לספק neuroprotection בעקבות שבץ. משיכות בקליפת המוח קטנות וmi…

Materials

			Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
			[header]
			Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53