Athymic الجرذ نموذج لتقييم المهندسة الرباط الصليبي الأمامي الطعوم
Summary
Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.
Abstract
Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.
Introduction
تمزق في الرباط الصليبي الأمامي (ACL) هي واحدة من معظم إصابات الرباط مشتركة في الركبة 1. لأن تمزق في الرباط الصليبي الأمامي غير قادر على شفاء دون تدخل جراحي، والقيود المفروضة على أنشطة الحياة اليومية، وكذلك المشاركة في الألعاب الرياضية بالسيارة أكثر من 175،000 المرضى لإجراء عملية جراحية سنويا 2، بتكلفة تقديرية تبلغ مليار دولار سنويا 3. حاليا، يتم استخدام إما الطعم الذاتي أو المزروع وتر لإعادة الإعمار الرباط. على الرغم من معدلات نجاح عالية لا يمكن أن يتحقق مع كل من الطعم الذاتي والمزروع الاستبدال، وترتبط مضاعفات خطيرة مع خيارات إعادة الإعمار هذه 4. ويرتبط الأنسجة الطعم الذاتي مع الموقع المانحة الاعتلال ويقتصر في العرض، خصوصا في حالات إعادة تمزق أو إصابة متعددة الرباطية. من ناحية أخرى، يرتبط النسيج المزروع مع التكامل تأخر الكسب غير المشروع، والاستجابة الالتهابية الضارة ومخاطر المعدية النظري، والملحق محدودلاي 5. وقد وضعت الطعوم غير القابلة للتحلل الاصطناعية في 1970s و 1980s ولكن تم تعيق من السابق لأوانه تمزق الكسب غير المشروع، وردود الفعل جسم غريب، وعظام النهايات، وداء التهاب الغشاء المفصلي 6. ونتيجة لهذه المخاوف الخطيرة، وهناك حاليا أي الطعوم الاصطناعية متاحة للاستخدام السريري في الولايات المتحدة.
بسبب هذه القيود مع خيارات الكسب غير المشروع القائمة والتطورات الأخيرة في علم الأحياء والهندسة والطب التجديدي، كان هناك اهتمام كبير في حل الأنسجة المهندسة لACL التطعيم. استراتيجيات هندسة الأنسجة الحالية تستخدم المواد البيولوجية والاصطناعية القابلة للتحلل للسماح نشوب الأنسجة المضيف مع تجنب القيود المرتبطة المواد الاصطناعية الدائمة زرع 7.
Polycaprolactone (PCL) هو بوليمر قابلة للتحلل هذا هو FDA وافقت لعدد من التطبيقات الطبية بما في ذلك الحاجز التصاق وتضميد الجرح 8، التي كانت شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في مجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك الأوعية الدموية والعظام والغضاريف والأعصاب والجلد وهندسة الأنسجة المريء 5،9-16. توافق مع الحياة مواتية، لفترة طويلة نسبيا في الجسم الحي نصف الحياة، والقوة الميكانيكية الكافية، ومرونة عالية تساهم في شعبية هذا البوليمر في هندسة الأنسجة. في نموذج القوارض من التئام الجروح، وقد تبين مزروع PCL electrospun أن تكون غير مناعة وعلى الاندماج في النسيج المحلية دون ردود فعل سلبية 13. ويظهر صورة SEM من electrospun PCL في الشكل 1.
مع الحالية FDA التنظيمية المعايير وفعالية وسلامة في كل النماذج الحيوانية الصغيرة والكبيرة ستكون هناك حاجة لPCL أو أي ACL الكسب غير المشروع هندسيا آخر للانتقال إلى التجارب السريرية في الولايات المتحدة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الظروف في الجسم الحي في كثير من الأحيان تزيد خصائص من ACL الكسب غير المشروع الأنسجة في المختبر هندسيا. نموذج الفئران من إعادة الإعمار ACL ذاتي مع المثنية digitorأم إبهام اليد وتر وقد وصفت سابقا، والذي كان قطعت ACL الأصلي، الفخذ وتم حفر أنفاق عظام الساق، وصدر الكسب غير المشروع والمضمون في مكان مع خياطة 17-22. في هذه الورقة، فإننا سوف تصف تعديل هذا النموذج لتقييم بدائل ACL هندسيا وليس من أجل إعادة البناء القائم على الطعم الذاتي (الشكل 2).
على الرغم من أن العديد من نماذج حيوانية موجودة لهندسة الأنسجة الرباط، والفئران هو مفيد بالمقارنة مع النماذج الكبيرة لعدد من الأسباب. وتشمل هذه المزايا أسهل تربية والمناولة، والاعتبارات الأخلاقية أقل، وانخفاض 17،23 التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نموذج الفئران على نطاق واسع نموذجا لتجديد الأنسجة العظمية، بما في ذلك الغضاريف والأوتار، وهندسة الأنسجة العظام 24. على وجه الخصوص، تم اختيار الفئران عارية athymic بسبب افتقارها إلى الخلية بوساطة استجابة مناعية 25، والسماح للفي نهاية المطاف زرع سالخلايا المانحة xenogeneic و في هذا النموذج لزيادة تعزيز الكسب غير المشروع هندسيا في المستقبل. في هذه الورقة الأساليب، وصفنا تصنيع وزرع جراحية لاخلوي، البوليمر الكسب غير المشروع القابلة للتحلل في نموذج الفئران athymic إعادة الإعمار ACL.
Protocol
Representative Results
Discussion
إصابات ACL هي حالة شائعة في جراحة العظام الرياضية، مع خيارات محدودة لإعادة الإعمار في الوقت الحاضر. من أجل تطوير الأنسجة المهندسة بديلا مناسبا للACL من شأنها أن تسمح تجديد في الجسم الحي، لا بد من نموذج حيواني مناسبة. في هذه الدراسة، وصفت تلفيق من الكسب غير المشروع ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر غابرييل أروم ومايكل Yeranosian للمساهمات التقنية لتكرار السابقة من هذا المشروع. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل الطبيب السريري OREF عالم التدريب غرانت (NL)، سمو لي الجراحية بحوث غرانت (NL)، وقدامى المحاربين إدارة BLR & D مراجعة الاستحقاق 1 I01 BX00012601 (DM) والعضلات والعظام زرع جائزة الباحث الشاب مؤسسة (FP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) | Lactel Absorbable Polymers | Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18G x 1 1/2"bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1 1/2" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
