키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
질병의 부재하에 면역 학적 기억의 발생이 효율적으로 접종 한 생리 기초이다. 최근, 시스템 생물학 기반의 접근 방식은 이러한 황열병 백신 성공적인 백신, 차례로, 리드 항원의 활성화를 multilineage하는 선천성 면역 반응과 수지상 세포 (DCS)의 여러 부분 집합의 활성화 강력한 유도를 유도하는 것으로 밝혀졌다 특정 T 세포 2,3-. DC가 항원 특이 나이브 T 세포 (4)를 활성화 할 수있는 능력을 가진 경우에만 면역 세포 집단이므로, 예방 접종 동안 그들의 기능의 연구는 백신에 대한 면역 반응을 이해하고 도전 병원균 미래 전략을 설계하는 것이 중요하다.
백신에 대한 면역 반응시 DC가 다른 서브 세트들의 추적을 허용하는 시스템을 제공하는 것이다 림프 조직으로 DC 이동의 정확한 동력학을 설정하기 위해 바람직하고, 것백신 특정 적응성 면역 개시 할 책임 생리 메커니즘 통찰력. 유전학을 기반 역방향 접근 방식은 가능성이 수정 생성이 목적으로 실험적으로 사용할 수있는 생균 백신을 제공합니다. 인플루엔자 연구에 구현하기 때문에, 플라스미드 – 기초 역 유전학 널리 LAIVs 포함한 재조합 인플루엔자 균주를 생성하기 위해 사용되어왔다. 표준 프로토콜은 (재조합 인플루엔자 바이러스는 Madin-다비 개과의 신장과 같은 허용 시스템에서의 증폭뿐만 아니라 여덟 인플루엔자 바이러스 분절을 함유 ambisense 플라스미드 매우 형질 세포주 (포지티브 및 네거티브 센스 RNA 모두 제조)의 다 형질을 필요 구출 MDCK) 세포 및 / 또는 닭 유정란 5. 그러나, 백신의 면역 기전을 연구하기 위해 분자 도구를 생성하는 역 유전학의 적용은 비경 남아있다.
세대수지상 세포를 포함하는 면역 세포 하위 집합의 특정 고갈을 허용하는 새로운 마우스 모델, 백신 유도 보호의 기초가되는 기본 면역 메커니즘을 이해하는 새로운 가능성을 열었다. 마우스와 인간에서의 DC 서브 세트 함수 사이의 비교는 크게, 마우스 및 인간 DC가 강하게 상동 기능적 이러한 발견 -6,7-있는 마우스 모델의 개발은 정상 상태의 DC 특이 공핍을 허용하는 것이 제안 것을 밝혔다 염증 상태 동안, 인간 DC 응답의 생리를 이해 될 수있다. 최근 마우스 모델의 수는 8,9 관심의 유전자의 프로모터 영역의 제어하에 유인원 디프테리아 독소 (DT) 수용체 (DTR)를 발현하는 유전자를 운반 생성되었다. 마우스 조직 자연스럽게 DTR을 표현하지 않기 때문에,이 모델은 DT와 마우스 접종에 따라 관심의 대상으로 유전자를 운반하는 세포의 부분 집합의 조건 고갈을 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 abili생리 학적 과정에서 생체 내에서 특정 수지상 등의 백혈구를 소모하는 타이는 크게 DTR 기반 RO의 개발에 의해 향상되었습니다. 이들 트랜스 제닉 마우스 모델은 면역계의 개체 발생을 이해하기 위해 광범위하게 사용되었지만 그러나, 백신 개발에 따라 적용이 부족하게 테스트되지 않았다. 여기서, 인플루엔자 역 유전학 DTR 기반 경쟁 골수 키메라를 결합함으로써, 우리는 생체 내에서 백신에 대한 면역 반응 동안 백신 면역뿐만 아니라 개개의 유전자 기능의 동역학을 연구하는 방법을 제안한다. 도전 감염성 질병에 대한 새로운 백신의 임상 평가를 위해이 기술의 응용은 백신 설계 합리화 및 생체 내 백신 후보를 테스트하는 데 도움이 될 수.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 백신 유발 면역 생리학 및 분자 메커니즘을 규명하기 위해 이용 될 수있는 방법을 역 유전학 및 키메라 마우스 모델을 설명한다. 인플루엔자 역 유전학은 많은 실험실에서 설립 및 인플루엔자 발병 기전, 복제 및 전송 (17)을 이해하는데 주요한 역할을하고있다. 우리의 프로토콜의 핵심은 외국 항원을 표현 추위 적응 인플루엔자 백신의 구조입니다. 뉴 라미의 줄기로 짧은 cD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
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