여기에서는 아밀로이드-베타의 직접 입체성 뇌 주입을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 뇌 뉴런에 대한 아밀로이드-베타의 단기적인 영향을 해결하기 위한 대안적인 생체 내 마우스 모델을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
알츠하이머 병은 고령화에 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환이다. 질병의 주요 신경 병리학 적 특징은 아밀로이드 - 베타의 과잉 생산과 고통받는 사람들의 뇌 영역에서 아밀로이드 베타 플라크의 증착이다. 지난 몇 년 동안 과학자들은 아밀로이드 - 베타 병리를 복제하려고 많은 알츠하이머 병 마우스 모델을 생성했다. 불행히도, 마우스 모델은 선택적 질환 특징을 모방. 신경 세포 사망, 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 현저한 효과가 현저 이들 마우스에서 부족하다. 뉴런 가장 독성임이 입증되었다 아밀로이드 - 베타의 형태 - - 따라서, 우리 등은 직접 아밀로이드 - 베타의 수용성 올리고머 종을 주입하는 방법을 채용 한 stereotaxically 뇌로. 이 보고서에서 우리는 선택 뇌 영역에 아밀로이드 - 베타 수준을 증가의 수술 기법을 문서화하는 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용합니다.콜린성 회로에 의해 접속되어 기저 전뇌와 함께이 뇌 구조체가 변성 질환의 영역 중 하나 나타내므로 투여 대상은 해마의 치아 이랑이다. 브로카의 대각선 대역의 수직 사지에서 세포 사멸 및 콜린성 뉴런 손실에 수반하는 증가가있을 정위 주입을 통해 치아 이랑에서 아밀로이드 베타 상승의 결과, 1 주 내에 치아 이랑에서 신경 세포 손실의 증가를 나타내 기저 전뇌의. 이러한 효과는 2 주까지 관찰된다. 우리의 데이타는 현재 아밀로이드 베타 주입 모델은 단기간에 특정 영역의 신경 세포 사멸을 해결하기위한 대안이 마우스 모델을 제공한다는 것을 시사한다. 이 모델의 이점은 아밀로이드 - 베타가 시공간하게 증가 될 수 있다는 것이다.
서론
아밀로이드 - 베타 (Aβ 1-42)으로 구성되어 아밀로이드 플라크 예금, 알츠하이머 병 (AD)의 병리의 핵심 기능입니다. 많은 연구는 신경 세포의 죽음, 시냅스 영양 장애, 손실 및 기능 장애를 유발 재조합 올리고머 Aβ 1-42의 높은 독성 수준을 보여 주었다; 뿐만 아니라 학습과 기억 적자 1-4으로. 영향을받는 뇌 영역은 해마, 대뇌 피질, 그리고 기저 전뇌와 편도체 (5, 6)와 같은 피질 하 구조를 포함한다. 지금까지 광고의 Aβ 1-42 병리학을 시뮬레이션하려고 여러 형질 전환 마우스 모델이있다. 변형에 따라이 동물은 AD의 선택 병리학 적 기능을 검사에 유용하다는 것을 증명한다. 불행하게도,이 트랜스 제닉 라인들, 및 APP23 5XFAD 제외한 이들 마우스는 완전히 신경 손실, AD의 핵심 양태를 복제하지 않는다. 심지어 APP23 및 5XFAD에서 관찰되는 신경 세포의 손실, 신경 세포의 죽음 obser와VED는 몇 가지 선택 지역 7,8에, 미묘한 나이 의존하고 분리 하였다.
야생형 마우스의 뇌에 Aβ 올리고머 1-42의 직접 주입 amyloidopathy 1,9,10의
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프로토콜
참고 : 모든 동물 실험의 경우, 기관 및 관리 및 실험 동물의 사용을위한 국가 가이드 라인을 따라야했다.
1. 외과 수술 도구 및 솔루션을 준비
- 모든 스테인레스 스틸 수술 도구를 압력솥.
- 멸균 분자량 그레이드 탈 증류수 200 증명 무수 에탄올을 희석하여 70 % 에탄올을 준비한다.
- 해밀턴 주사기에 29 G 바늘을 연결합니다. 1 분 동안 반복 그리기 및 배출 nanopure 물에 의해 해밀턴 주사기와 바늘의 내부를 청소합니다. 70 % 에탄올로이 절차를 반복합니다.
- 해밀턴 주사기의 플런저와 바늘을 제거합니다. 공기는 층류 후드 O / N에서 부분 건조.
- 사용 전에 30 분 동안 자외선 바늘과 주사기를 조사.
- 0.9 %의 체적 농도로 최종 중량에 대한 분자 수준의 물에 용해하여 염화나트륨 식염수 용액을 준비한다. Sterili0.2 ㎛의 기공 필터를 통해 여과하여 용액을 ZE.
2. 올리고머 Aβ 1-42 준비
- 빠 '등 13 책에서 설명한대로 Monomerize과 정확히 5 mm로 DMS....
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결과
인간 재조합 올리고머 Aβ 1-42의 제조 본 방법은 단량체, 이량 체, 삼량 체 및 사량 체 (도 1A)으로 이루어진 수용성 올리고머 종을 산출한다. 이러한 저 분자량 Aβ 1-42 종 아니지만 브릴과 플라크 뉴런 1,4,9,17-19 가장 독성 수많은 설정에 도시되어있다. 올리고머 Aβ 1-42은 마우스의 뇌에서 Aβ 1-42 신경 세포 사멸을 유도하는지 여부를 결정하기 (100 μM 원액 4 μL)를 9개월 오래 야생형 C57BL 하나 반구에서 해마의 DG에 주입 하였다 / 6J 마우스. C57BL / 6J위한 해마의 중량은 약 0.018 g을 것으로 추정되므로 Aβ 1-42의 전달은 약 100 μg의 / g이었다된다. 아밀로이드 베타 1 용해에 사용 된 DMSO의 동일한 볼륨으로 구성 - 같은 마우스 뇌의 반대편 DG는 제어 / 차량 용액을 주입했다42 .......
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토론
1) 무균 기술을 사용합니다 : 실험자 또는 외과 의사가 반드시 성공적으로 Aβ 1-42 주사를 달성하기 위해 2) 올바르게 정확한 좌표와 관심의 뇌 영역을 식별; 3) 적절 AP 및 ML 축 평준화 뇌 정위 프레임에 마우스를 보호 할 수; 4) 정밀 미세 조작기를 작동 할 수있는 능력을 가지고; 5) 적절한 수술 치료를 보장합니다. 이러한 주요 단계는 다음 경우 마우스없이 관찰 감염으로 수술을 생존해야한다.
시험관에 있던 연구는 우리와 다른 Aβ 1-42 직접 해마에 주입이 광고의 주요 기능 중 하나를 묘사, 신경 세포 죽음 1,4,9,10을 이끌어내는 것으로 나타났습니다. 변성 한 마커의 증가에 의해 보완된다 치아 이랑의 체적 감소에 의해 도시 된 바와 같이, 변성은 주사 부위의 부근에서 명확하게 알 수있다. 또한, T그는 콜린성 라벨링 감소 및 BF 1,10에서
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 신경 질환의 국립 연구소에 의해 지원과 뇌졸중 알츠하이머 병 연구 투자 노화 (CMT에) NS081333, 알츠하이머 협회 보조금 NIRG-10-171721과 (어에) 정신 건강 보조금 MH096702의 국립 연구소 및 국립 연구소를 부여했다 (YYJ과 JB에) 컬럼비아 대학 파일럿 부여 AG008702에서 센터.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 케타민 HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 동물 1kg당 케타민 100 mg 케타민 |
| 자일라진 (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | 사용 불가 | 동물 1kg 당 10 mg 자일라 |
| 진 Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 동물 1 kg 당 0.1 mg 부프레넥스 |
| Aβ 1-42 | David Teplow/UCLA | 이용 불가 | 100 μ M; 이 아밀로이드는 |
| A&beta 논문에 사용되었습니다. 1-42 | Bachem | H-1368 | Teplow lab A&beta의 아밀로이드 대신 사용할 수 있습니다 |
| . 1-42 | American Peptide | 62-0-80B | 는 Teplow lab |
| Scrambled A&beta의 아밀로이드 대신 사용할 수 있습니다. 1-42 | American 펩티드 | 62-0-46B | A&beta 비교를 위한 대조 펩티드로 사용될 수 있습니다; 1-42 |
| NU4 항체 (Oligomeric Amyloid 항체) | Gift from William Klein/Northwestern U. | 사용할 수 없음 | 1:2,000 희석 |
| 항-아밀로이드 올리고머 항체 (다클론 토끼) | EMD Millipore | AB9234 | 는 Nu4 대신 사용될 수 있으며; 최종 사용자에 의해 테스트되어야 합니다. |
| 6E10 항체 (Monoclonal Mouse) (Amyloid 항체) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 희석 |
| ChAT 항체 (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 희석 |
| DeadEnd 형광 TUNEL 시스템 | Promega | G3250 | 제조사의 지시사항을 따르십시오. |
| Invitrogen | P36935 | 와 함께 Prolong Gold Antifade Reagent | 슬라이드를 커버슬립할 때 사용 |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | 사용할 수 없음 | 2% 용액 |
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참고문헌
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
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