사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
병원균 특이 T 세포의 대체 전송이 방지 및 동종 조혈 줄기 세포 이식 후 발생하는 감염 (CMV)와 같은 사이토 메갈로 바이러스 기회 감염을 치료하는데 사용될 수있다. 타사 도너 포함한 동종 공여자로부터 바이러스 특이 T 세포를 선택적으로 목적하는 T 세포를 전파 항원 구동 자극 반복 라운드를 이용하는 현재 우수 제조 CGMP ()을 준수 생체 전파 될 수있다. 항원 특이 적 T 세포의 식별 및 분리는 감마 인터페론 (IFN-γ)를 분비하는 활성화 된 T 세포의 사이토 카인 캡처 시스템에 기초하여 수행 될 수있다. 제조 공정은 시간 소모적이며, 숙련 작업자를 필요로하지만, 면역 복원 돕는 사이토 카인 캡쳐 시스템 (CCS)의 광범위한 인간 응용이 제한되어왔다. 이제 이러한 CliniMACS 프로디지 같은 2 세대 셀 농축 장치의 개발자동화 덜 노동 집약적 인 시스템을 이용하여 바이러스 – 특이 T 세포를 생성 할 수 있도록 연구자. 이 장치는 자기 임상 등급의 제품을 생성하기 위해, 자기 활성화 세포 분류 기술을 이용하여 표지 된 세포로부터 세포를 분리한다 표지, 폐쇄 시스템으로 설계되며, 벤치 탑에 액세스하여 조작 할 수있다. 우리는이 새로운 자동화 된 세포 농축 장치의 동작은 CMV 혈청 양성 공여자로부터 얻은 정상 성분 채집 생성물로부터 수득 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 제조하는 것이 입증. 이러한 고립 된 T 세포는 다음 직접 기관 및 연방 정부의 규제 감독하에 환자에 주입 할 수있다. 적혈구의 제거를 비롯한 모든 생물 처리 단계는, T 세포, 항원 특이 적 T 세포를, 정제, 분리 및 세정의 자극은 완전 자동화된다. 이와 같은 장치는 애플리케이션에 대한 인간 T 세포 GMP (전용 우수 제조 밖에 제조 할 수있는 가능성을 높이기) 대신 시설은 직원이 여러 제품을 생산하는 자동화 된 프로토콜을 감독 할 수 혈액 은행 시설에서 생산 될 수있다.
Introduction
조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 1 이식편 대 종양 효과를 향상시키고, 기회 감염 (2)에 내성을 제공하는 T 세포 대체 요법과 결합 될 수있다. 주입을위한 항원 특이 기증자 유래 T 세포의 생성은 역사적으로 숙련 된 인력 및 GMP를 준수합니다 전문 시설의 사용을 요구하고있다. 이러한 T 세포의 전달 기회 감염 3 해상도뿐만 아니라 하부 암 (4)의 처리 결과이다. 최근 연구자들은 증명 그 천 단지 몇 바이러스 특이 적 T 세포의 대체 전송 (~ 1 × 10 4-2.5 × 105 세포 / kg받는 체중) 성공적 동종 조혈 모세포 5-9 후 편의적 CMV 감염을 치료할 수있다. 관련된 숙련 제조 요건 GMP 시설 제한된 수 및 셀 생산과 관련된 높은 비용 그러나 restr을 갖는다T 세포 치료 (10)를 약속에 icted 환자 액세스 할 수 있습니다. 항원 특이 적 T 세포를 분리하는 한 가지 방법은 CD45 및 IFN-γ을 인식하는 이중 특이 시약을 사용 CCS에 기초한다. 도시 된 바와 같이,이 방법은 자동화 된 세포 농축 CCS 장치 (도 1B)를 이용한 임상 등급 CMV 특이 T 세포를 생성하는데 사용될 수있다.
CMV 특정 T 세포는 CMV 혈청 검사 양성인 기증자로부터 백혈구 성분 채집 총 핵 세포 (TNC)와 CMV pp65 유래의 항원에서 중복 펩티드를 배양에 의해 생성됩니다. 인간 백혈구 항원 (HLA)의 맥락에서 디스플레이 이들 펩타이드, IFN-γ를 분비하는 TNC 내의 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 활성화. 이러한 T 세포는 "캡쳐"및 자기 적으로 분리 될 수있다. 제 세대 셀 농축 장치의 운전 (도 1a)는 복수의 착수 GMP 조건 하에서 세포 배양에서 숙련 된 사람이 필요하고, 직원의 코디"캡처 된"생성물을 생성하는 데 필요한 TEPS.
절차는 일반적으로 연속 운전의 12 시간에 10를 요구, 따라서 직원은 가능성이 GMP 시설에서 2 교대에 걸쳐 작업을 할 필요가있다. 이러한 제약은 이제 (도 1b에 도시 된) 제 2 세대의 장치에 의해 구현되어 없어진다. 이 장치는 1 세대 디바이스와 유사한 자기 농축을 수행하고 있지만, unbreached CCS 접근법의 다른 측면을 자동화한다. 이로 인해 공정의 대부분의 직원에 의해 자동으로 달성 될 수 GMP 팀의 부담을 감소시킨다. 장치는 밀폐 시스템으로서 동작하기 때문에, 항원 특이 적 T 세포를 포착하고 측량기를 시작하기 전에 백혈구 성분 채집 분리 및 재료의 제조에 포함 된 단계를 제외한 벤치 탑에서 처리 될 수있다. 전체 계측 및이 제 2 세대 세포 농축 장치의 기능의 세부 사항은 펍 된11 졌으.
여기서는 자동 세포 농축 CCS 시스템을 이용하여 정상 성분 채집 생성물로부터 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 풍부하게하는 단계를 설명한다. 일단 격리 이들 CMV 특이 T 세포는 즉시 환자에 주입 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
T 세포 대체 요법은 B 세포 악성 종양을 치료하기 위해 4 실행 가능한 옵션으로 떠오르고있다. 그 치료 가능성은 복제 성 노화 2 부족 표적 항원 특이 T 세포의 수를 주입에 의존한다. 이것은 현재의 양호한 제조 방법을 준수하여 확장 T 세포로부터 항원 특이 T 세포의 순수 인구를 선별함으로써 달성 될 수있다. 두 정렬 절차는 널리 즉, 형광 – 활성화 된 세포 (FACS)을 정렬 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
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