En ny ansökan av elektriska penetration Graph (EPG) för att förvärva och mäta elektriska signaler i floem sikt Elements
Summary
Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.
Abstract
Elektrofysiologiska egenskaper hos celler ofta studeras in vitro, efter att dissociera dem från deras naturliga miljöer. Emellertid studien av elektrisk överföring mellan avlägsna celler i en organism kräver in vivo, artefaktfria inspelningar av celler inbäddade i sin ursprungliga miljö. Överföring av elektriska signaler från sårade till oskadad områden i en fabrik har sedan länge väckt intresse hos botanister. Floemet, den levande delen av anläggningen vaskulaturen som är spridda över hela anläggningen, har postulerats som en viktig vävnad i elektrisk överföring i växter. Bristen på lämpliga elektrofysiologiska metoder innebär många utmaningar för studiet av de elektriska egenskaperna hos de floem celler in vivo. Här presenterar vi en ny metod för intracellulär elektro av siktelement (SE) som använder levande bladlöss eller andra floem-utfodring hemipteran insekter, integrerad i den elektriska penetration graph (EPG) krets. Mångsidigheten, robusthet, och riktigheten i denna metod gör det möjligt att spela in och i detalj studera de lindade-inducerade elektriska signaler i småföretag centrala venerna i modellväxten Arabidopsis thaliana 1. Här visar vi att EPG-elektroderna kan lätt implementeras för intracellulära elektrofysiologiska inspelningar av bolag i marginal vener, liksom för att studera förmågan hos bolag att reagera med elektriska signaler till flera externa stimuli. EPG strategi tillämpas på intracellulära elektro av SE kan genomföras till ett brett utbud av växtarter, i ett stort antal växt / insekts kombinationer, och för många forskning syftar.
Introduction
Förmågan att producera långväga elektriska signaler är ett fördelaktigt drag hos flercelliga organismer som möjliggör effektiva reaktioner på yttre stimuli. Detta drag har utvecklats oberoende i växter och djur, och utgör därmed ett fall av konvergent evolution. Med tanke på att elektriska signaler kopplas med viktiga funktioner i djur såsom neural överföring och muskelsammandragning, den molekylära grunden, mekanismen för överföring och funktion av stimulans-inducerad elektriska signaler hos djur är föremål för intensiv forskning. Däremot har stimulus-inducerad elektrisk signalering i växter fått lite forskning uppmärksamhet. Även växter har inga nerver eller muskler, det verkar finnas tillräckligt med bevis för att anta att stimulans-inducerad elektriska signaler i växter spelar en viktig roll i sina svar på miljöfaktorer.
Floemet, den levande komponent i anläggningen vaskulaturen, har postulerats som en viktig understrate för överföring av stimulans-inducerad elektriska signaler från stimulerade / skadade till icke-stimulerade / oskadade områden 2. De huvudsakliga cellerna i floem är siktelementen (SES), relativt enkla, långsträckta celler. Ändarna av bolag är anslutna till andra bolag, bildar en kontinuerlig, låg resistans, sikt rörsystem som är spridda över hela anläggningen. Det finns emellertid mycket få studier på de elektriska egenskaperna hos dessa mycket specialiserade celler. I dessa tidigare studier, forskare åt bolag med antingen glasmikroelektroder 3 eller med glaselektroder som är kopplade till anläggningen-införda nålar av bladlöss, efter stylectomy (skärning) 4. Glasmikroelektroder är gjorda av glaskapillärer som dras vid en ände med värme till en fin spets av mindre än 1 pm i diameter, och därefter fylls med en KCl-lösning. En Ag / AgCl eller platinatråd, införd i KCl-fyllda glaselektrod kopplas sedan till förstärkaringången, samt en referenselektroden införes i badet som omger cellen av intresse, sluter kretsen. Denna setup registreras skillnaden i potential mellan den extracellulära referent elektroden och den intracellulära mätelektroden, dvs membranpotentialen hos cellen 5. Med denna metod Umrath gjorde den första intracellulära inspelning från en växtcell, med användning av alger Nitella 6,7. Nitella är en relativt enkel organism med stora celler, och därför mottagliga för intracellulära elektrofysiologi experiment. Däremot är införandet av intracellulära glaselektroder i de små cellerna i flercelliga, tredimensionella landväxter tekniskt krävande, kräver en mycket skicklig forskare, liksom sofistikerade visualisering, mikromanipulation, och anti-vibrationsutrustning. Även glaselektroderna kan användas för att spela in från ytliga celler i växter, såsom rot epidermalceller 8, intracellulär recordings från celler djupt inbäddad i anläggningen vävnad, såsom bolag, mycket sannolikt orsaka skada-inducerade svar, förvirrande resultat. År 1989, Fromm och Eschrich rapporterat användning av en alternativ metod, kallad "bladlössens metoden", där glaselektroder är kopplade till bladlöss nålar efter stylectomy 4. Den bladlöss Metoden är minimalt invasiva, eftersom flexibla nålar inte orsakar vävnad eller cellskador som glaselektroder gör. Bladlöss mandränger är naturens stora uppfinning för växt penetration och bladlöss är betydligt skickligare än människor att hitta bolag. Tyvärr är detta bladlöss metod också mycket krävande när det gäller teknisk expertis och utrustning. Dessutom framgången för varje experiment som implementerar denna teknik är helt beroende av bladlöss är i matningsmod – med stiletten stabilt insatt i en SE, vid tidpunkten för stylectomy. Tänkande i efterhand kan man se att oddsen för framgång av denna teknik kunde ha varit jagmproved genom att till försöksuppställningen ett instrument som gör det möjligt att identifiera huruvida aphid mandrängen är i SE vid tillämpningen stylectomy.
År 1964, McLean och Kinsey beskrev ett "elektroniskt övervakningssystem" för studier av ätbeteende av bladlöss i realtid 9,10. I detta system, var det bladlöss och nålen-trängde anläggningen integreras i en elektrisk krets. Senare, 1978, Tjallingii utarbetat en modifierad version av systemet, som kallas "Elektriska penetration Graph" (EPG) systemet 11,12. Den ursprungliga elektroniska övervakningssystemet var känslig för motstånds-ursprung potentialer endast med EPG-systemet, den elektromotoriska kraften (EMF) har sitt ursprung potentialer, det vill säga, som genereras i anläggningen eller i insekten, kan registreras förutom potentialer till följd av motstånd (R) i insekten. Detta utgör en viktig förbättring, eftersom både signal komponenter, EMF och R,tillhandahålla biologiskt relevant information om händelser under växt penetration av bladlöss. Vad gör EPG förförstärkaren känslig för R-komponenter är dess relativt låga ingångsmotstånd av 1 GΩ, vilket är nära genomsnittet för anläggningen / bladlöss motstånd. En liten offsetspänning (Figur 1, V) på cirka +100 mV appliceras på anläggningen, som sedan delas mellan växt- och insekts å ena sidan, och ingångsmotståndet på den andra. De spänningar och deras ändringar mäts vid en punkt (figur 1 A, B) mellan insekten och ingångsmotståndet. Därför R-komponenterna representerar växt bladlössens motståndsmoduleringar av offsetspänning, medan EMF-komponenter är en viss andel av växtpotential på sondspetsen och potentialer orsakade i insekten. Växt potentialer – mest relevanta här – är främst membranpotentialer i växtceller punkterade av bladlöss nålar. De insekts potentialer verkar vara huvudsakligenstreaming potentialer orsakade av flytande rörelser inom de två stiletten kanalerna, det vill säga mat och spott kanalerna; inga interna nerv eller muskelpotentialer registreras i EPG. I praktiken fungerar mandräng spets som en elektrodspets. Alla växtceller är negativt laddade inne i förhållande till den positiva utsidan av cellen. Den elektriska strömmen (dvs förflyttning av laddade joner i vattenlösning), som strömmar från insidan till utsidan och vice versa är mycket begränsad på grund av den höga resistansen hos cellmembranet. Normalt vilopotentialen hålls konstant. När emellertid negativa joner flyttar ut eller positiva joner flytta in genom cellmembranet, är membranpotential reduceras, dvs det depolariserar '. Depolarisering sker vid cell excitation. Joner sedan flytta in eller ut när specifika jonkanaler i membranet öppnas eller då membranet är skadat och joner läcka in och ut. Alla celler har jonkanaler och pumpar i than plasmamembran som bringa membranpotentialen till dess vilonivå genom att återställa den ursprungliga koncentrationen av olika joner inuti cellen. Den vilopotential och dess förändringar är emf komponenter, och därför är det EPG-tekniken är lämplig för att mäta dem.
Figur 1. EPG-elektroder. EPG-elektroden är en levande bladlöss integreras i elektrisk penetration Graph (EPG) krets, vars nålen sätts in i en sil element (SE) i stabil matningsmod. Om nålen-spetsas SE är i vila (panel A), spänningen i kretsen, inspelad av EPG, är stabil och på vilopotential nivå (panel C, vila). Om SE är upphetsad, dess membran depolariserar (panel B), som visualiseras i EPG som en gradvis ökning i spänning (panel C, Depolarisering). Som jonbalansen i SE-återgår till vila, dvs det repolarizes spänningen registreras av EPG minskar gradvis till resten potentiella nivån (panel C, repolarisation). I panel C, "A" och "B" hänför sig till de scenarier visade i panelerna A och B, respektive. V = Justerbar offsetspänning källa. Ri = Ingång motstånd. Parallellt med 1 GΩ externt motstånd, har ett internt (i OpAmp) höga 1,5 TΩ motstånd (paneler A och B, i grått) förstärkaren. Genom fjärrstyrning av växeln EPG förförstärkaren kan ändras från normal till EMF-läge, vilket gör det möjligt att få mycket exakta spänningsvärden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I nästa avsnitt ger vi läsaren en grundläggande protokoll för att utföra EPG experiment som gäller för både insekts fokuserad och växtfokuserad studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för att göra elektrisk penetration Graph (EPG) inspelningar. EPG-tekniken är väl etablerad, med 100-200 aktiva användare världen över, och det har införts för många studier om olika ämnen, till exempel: a) värdväxt resistens mot bladlöss och andra Stylet bärande insekter 13; b) växtvirus och patogena överföringsmekanismer 14; c) insekts verkningsmekanism, (förändringar toxicitet och beteende) 15; d) EPG har även …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VSR stöddes av en IIF Marie Curie Grant (sår i EARTH, akronym för: Sår inducerade elektriska signaler i Arabidopsis thaliana).
Materials
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is x10 | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A., Brette, R., Destexhe, A. Intracellular Recordings. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
