Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Summary

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Abstract

Generación de células madre pluripotentes inducidas (CMPI) a partir de fibroblastos de la piel de adultos y la posterior diferenciación en células somáticas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos que eluden las barreras de histocompatibilidad. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y la posterior diferenciación en linajes deseados completa sigue siendo un obstáculo para la traducción clínica de la tecnología de IPSC debido a la inestabilidad potencial y genómico neoplásica asociada. Recientemente, nosotros y otros mostraron que las células somáticas no sólo pueden ser convertidos en iPSCs sino también en diferentes tipos de células madre somáticas multipotentes mediante el uso de factores definidos, eludiendo así la progresión a través del estado pluripotente. En particular, la conversión directa de fibroblastos humanos en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) anuncia la posibilidad de una nueva fuente de células autólogas para diversas aplicaciones tales como el reemplazo de células, el modelado de la enfermedady la detección de drogas. Aquí se describe el aislamiento de fibroblastos primarios humanos adultos por biopsia de la piel y su conversión directa eficiente en iNPCs por expresión oportuna restringido de Oct4, Sox2, Klf4, así como c-Myc. Colonias neuroepiteliales Sox2 positivos aparecen después de 17 días de inducción y líneas INPC se pueden establecer de manera eficiente por el aislamiento y la expansión monoclonal. Ajuste preciso de la multiplicidad de la infección viral y la suplementación de factor inhibidor de leucemia durante la fase de inducción representan factores críticos para lograr eficiencias de conversión de hasta el 0,2%. Hasta el momento, INPC líneas específicas del paciente podrían ampliarse por más de 12 pasajes y uniformemente muestran rasgos morfológicos y moleculares de las células madre / progenitoras neuronales, como la expresión de nestina y Sox2. Las líneas INPC pueden diferenciarse en neuronas y astrocitos, a juzgar por la tinción contra Tuj1 y GFAP, respectivamente. En conclusión, se presenta un protocolo robusto para la derivación y gravect conversión de fibroblastos humanos en células progenitoras neurales de forma estable expandibles que podrían proporcionar una fuente celular para aplicaciones biomédicas, tales como el reemplazo de células neurales autólogo y el modelado de la enfermedad.

Introduction

En 2006 Yamanaka y sus colegas pudieron mostrar por primera vez la posibilidad de reprogramación de células somáticas en un estado pluripotente ^1. Este desdiferenciación se logró mediante la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc y en fibroblastos murinos. Los llamados células madre pluripotentes inducidas generadas (iPSCs) muestran equivalencia funcional a las células madre embrionarias (CES) y por lo tanto pueden diferenciarse en todos los tipos celulares del organismo adulto. Un año más tarde la reprogramación de células iPS también podría lograrse para los fibroblastos humanos ^2. Los experimentos en modelos animales demuestran que las células derivadas de IPSC generalmente se pueden utilizar para la terapia de reemplazo celular, por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson (PD) ^3-5. Sin embargo, varias limitaciones asociadas con el uso de iPSCs representan obstáculos para la plena realización de su potencial terapéutico. En primer lugar, la reprogramación de las células en un estado pluripotente y posteriorcontrol de calidad es generalmente un tiempo y proceso ineficiente rendimiento en los procedimientos extensos y por lo tanto costosos de cultivo celular. En segundo lugar, iPSCs necesitan ser re-diferenciado en el tipo de célula deseada de interés antes de la aplicación biomédica y la probabilidad de células pluripotentes residuales en la población diferenciada alberga un potencial tumorigénico significativa y por lo tanto muestra un alto riesgo después de trasplante de células ^6. En tercer lugar, el proceso de reprogramación se consigue normalmente mediante la inducción de los factores de reprogramación por la infección lenti- o retroviral. La integración de estos virus en el genoma huésped podría conducir a la mutagénesis de inserción y / o reactivación incontrolada de los transgenes ^7,8. Los sistemas no integrativos se han desarrollado para entregar los factores de reprogramación a las células diana, que minimizan el riesgo de mutagénesis por inserción y la reactivación del transgén. Ejemplos de estos enfoques transgenes libre son la reprogramación de las células utilizando no la integraciónAdeno o virus Sendai ^9,10, vectores basados ​​en ADN ¹¹ o la aplicación de métodos de ADN libre, como la transfección de ARNm sintético ¹² o transducción de proteínas recombinantes ^13,14. Otro método prometedor para la derivación de-transgén libre IPSC es el uso de constructos de reprogramación lentiviral modificado loxP-y la posterior eliminación de los transgenes utilizando el sistema de recombinación Cre-loxP de ADN ^15,16.

Un enfoque más directo para generar células neurales de la terapia de reemplazo celular representa la conversión directa de los fibroblastos en neuronas post-mitóticas ^17-20. Vierbuchen et al. Informó de que la sobreexpresión de factores de transcripción Ascl1, Brn2 y Myt1l resultados en la generación de 20% neuronas de fibroblastos murinos ^17. En 2011 se demostró, que los mismos tres factores de transcripción en combinación con sobreexpresión de NeuroD1 permiten transdiferenciación de fibroblastos humanos en neuRons ^19. Neuronas inducida humanos también podrían ser generados por la sobreexpresión de Ascl1 y Ngn2 bajo dual SMAD- e inhibición GSK3β- ^20. En particular, la conversión directa de los fibroblastos en neuronas genera una población de células no proliferativa, post-mitótico que no permite una mayor expansión y bancos biológicos.

Recientemente, la conversión directa de fibroblastos en una población de células neurales madre / progenitoras proliferantes se informó ^21-26. Para mayor claridad, todos estos tipos de células se denominan como células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) en este informe. Han et al. Sobreexpresa Brn4, Sox2, c-Myc y Klf4 para generar iNPCs. Al igual que sus contrapartes de células madre neurales derivadas de células de tejido, ya sea primaria o pluripotentes estos iNPCs son tripotential y podrían diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos ^21. Nuestro grupo informó de un protocolo de conversión ligeramente diferente que implica la sobreexpresión de Sox2, Klf4, Y c-Myc y inducida Oct4-expresión para sólo 5 días. Con este enfoque podemos generar de forma estable en proliferación iNPCs desde embrionarias y adultas fibroblastos murinos que exhiben silenciamiento completo de la reprogramación factores ^22. En contraste con la CMPI, iNPCs no presentan un potencial tumorigénico después del trasplante ^27. Utilizamos células convertidos con éxito en un modelo animal de la desmielinización, ratas con deficiencia de mielina, lo que demuestra que iNPCs son clínicamente útil ^22. Hasta entonces, los NPCs podrían solamente generan a partir de células madre pluripotentes o tejido neuronal primaria ^28-32. iNPCs son células de forma estable expandibles que pueden ser criopreservados y son capaces de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Se han hecho grandes esfuerzos para adaptar el protocolo de conversión directa de ratón para células humanas ^23,26,33,34. En 2012 se publicó que la sobreexpresión de la Sox2 solo factor en fibroblastos es suficiente para generar murinos y humanos iNPCs <shasta> 33. Los autores informaron generación de iNPCs humanos de fibroblastos de prepucio fetales y les caracterizan por tinción contra Sox2 y Nestina. Sin embargo, las células diana utilizados para la reprogramación representan un tipo de célula muy particular que no va a estar disponible en la práctica clínica y no había caracterización funcional de las células convertidas por el trasplante en un modelo animal realizado. Una publicación más reciente describe la generación de los progenitores restringidas neuronales a partir de fibroblastos fetales humanos por la sobreexpresión de Sox2, c-Myc y, o bien Brn2 o Brn4 ^34. Las líneas celulares generadas mostraron la capacidad de auto-renovación y podrían diferenciarse en varios tipos de neuronas terminales. Sin embargo, el uso de fibroblastos fetales es desfavorable, ya que estas células son de origen heterogéneo y uno no puede excluir la presencia de, por ejemplo residual, las células madre de la cresta neural en las preparaciones. En 2014, Zhu et al. Reportaron la conversión directa de un adulto humano y el neonatales fibroblastos en células progenitoras neurales tripotential por la sobreexpresión de Sox2 junto con Oct4 o Oct4 solo y adición de pequeñas moléculas a los medios de cultivo celular. En particular, sobre la base de sus estudios Sox2 sola fue insuficiente para inducir la conversión directa ^26. Más recientemente, Lu et al. Informó de que la sobreexpresión de la Yamanaka factores de Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc por el virus de Sendai durante 24 horas y la posterior inactivación del virus por el aumento de temperatura da como resultado la generación de neural tripotential expandible células precursoras ^23. En conclusión, aunque los protocolos de conversión publicados para las células humanas hasta ahora tienen en común la sobreexpresión de al menos uno o más de los factores Yamanaka, a menudo en una manera oportuna restringido, no hay ninguna indicación clara de los factores moleculares mínimos necesarios para conducir directa conversión en iNPCs. La sobreexpresión oportuna restringido de Oct4 por medios genéticos, la transfección con mRNA sintético, o cproteína ell-permeante junto con la expresión constitutiva de Sox2, Klf-4, y c-Myc no resultó en líneas estables INPC humanos todavía. Por lo tanto, la aplicación de virus Sendai para sobreexpresar todos los factores Yamanaka y oportuna restringir su actividad por la inactivación por calor del virus ²³ junto con las condiciones de inducción neural medios optimizados ^22,31 representa la estrategia preferida hasta el momento.

Varios estudios demuestran la funcionalidad celular de NSCs o sus homólogos diferenciados en diferentes modelos de enfermedad animal. Progenitores neuronales a partir de células madre pluripotentes humanas se han trasplantado en modelos de ratón de la enfermedad neuroinflamatoria esclerosis múltiple ^35,36. La aplicabilidad de las células progenitoras neuronales de células madre derivadas de la EAE (encefalomielitis autoinmune experimental) -mice fue mostrado por primera vez en 2008 ^35. Células precursoras neuronales multipotentes fueron inyectadas en los ventrículos del cerebro de ratón, y el resultado del trasplanteed en la reducción de los signos clínicos de EAE. Kim et al. Generada precursores oligodendrogliales de hESCs y trasplantado los intracerebroventricular en EAE-ratones. Aunque los trasplantes no sobrevivieron durante más de 10 días, los ratones mostraron una mejoría significativa de la función neurológica y la reducción de las células inmunitarias proinflamatorias en la materia blanca ^36. Terapia con células madre también se ha aplicado para preclínicamente focalización de la enfermedad de Parkinson como NPCs podrían ser empleados con éxito en los modelos animales respectivos. Para ello, las células progenitoras o bien se derivan de tejido cerebral fetal ³⁷ diferenciadas a partir de células madre pluripotentes ^38-40 o células madre mesenquimales ⁴¹ se han utilizado. En 2012 se demostró que iNPCs ratón son capaces de producir la proteína proteolipídica, el principal componente de proteína de la mielina, después del trasplante en el cerebro de ratas (md) mielina deficientes ^22. Por ese experimento el applicabil terapéutica prueba de principiodad de iNPCs fue probado en primer lugar y luego confirmado por otro estudio ^32. Sin embargo, el potencial de uso terapéutico de iNPCs humanos queda por explorar.

Aquí mostramos un proceso robusto e integrado de (i) obtención de células primarias humanas de pacientes adultos a través de biopsia de la piel, (ii) la conversión directa de los fibroblastos humanos en un estado progenitor neural y (iii) la capacidad de iNPCs a diferenciarse en neuronal y linajes gliales. El uso de este protocolo ayudará a acelerar la generación de células humanas autólogas para aplicaciones terapéuticas.

Protocol

Los fibroblastos humanos utilizados en este estudio se obtuvieron a partir de una biopsia de la piel después de obtener el consentimiento informado y la aprobación ética por el comité de ética de la Universidad de Würzburg, Alemania (informe de ética no: 96/11 de fecha 06/10/2011). 1. Golpe Biopsia Desinfectar la piel del paciente. Anestesiar parte de la piel de los que la biopsia se tomará de (preferentemente una zona menos expuesta al sol) con 0,5 a 1 ml de clorhidrato d…

Representative Results

Aquí presentamos descripción de un proceso integrado que permite la generación de células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) a partir de fibroblastos humanos que se han obtenido por una biopsia en sacabocados de la piel en menos de 8 semanas (Figura 1). INPCs-Paciente specifc se pueden diferenciar aún más en linajes neuronales y gliales y albergan un enorme potencial para la terapia de reemplazo celular y el modelado de la enfermedad. La infección de los fibrob…

Discussion

Aquí mostramos el aislamiento y la conversión directa de fibroblastos humanos en células progenitoras neurales-transgenes libre expandibles y su progenie diferenciada como base putativo para la terapia de células de reemplazo o aplicación en los análisis de detección de drogas. Conversión linaje directo de las células somáticas en los NPCs se ha logrado mediante la expresión forzada de transcripción específicos de linaje factores ^26,33,34. Sin embargo, en muchos casos se utilizaron fibroblastos f…

Materials

Astrocyte media	ScienCell	1801
B27	LifeTechnologies	17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
Biopsy Punch	pfm medical	48301
cAMP	Sigma	A6885
CHIR99021	Axon medchem	1386
Collagenase Type2	Worthington Biochemical	LS004177
Dispase	PAN	P10-032100
DMEM	LifeTechnologies	41966-029
DMEM F12	LifeTechnologies	11320-033
DMSO	Roth	4720
DPBS	LifeTechnologies	14190-094
EGF	Life Technologies	PHG0313
FCS	Biochrom AG	50115
GDNF	Peprotech	450-10
Gentamicin	Sigma	G1397
GFAP-antibody	Dako	Z0334
GlutaMAX	LifeTechnologies	35050-038
hLIF	Peprotech	300-05
Insulin	Seralab	GEM-700-112-P
Ki67-antibody	NeoMarkers	RM-9106-S
L-Glutamine	LifeTechnologies	25030-024
Laminin	Sigma	L2020
N2	LifeTechnologies	17502-048
Nestin-antibody	R&D Systems	MAB1259
Neurobasal	LifeTechnologies	21103-049
Non-essential amino acids	LifeTechnologies	11140-050
NSC freezing media	Sigma	C6295
Oct4-antibody	Santa Cruz	sc9081
Pax6-antibody	Covance	PRB-278P
SB431542	Invivogen	inh-sb43
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit	LifeTechnologies	A1378001
Sodiumpyruvate	Life Technologies	11360-039
Sox1-antibody	R&D Systems	AF3369
Sox2-antibody	R&D Systems	MAB2018
T3	Santa Cruz	sc-205725
Trypsin/EDTA	Life Technologies	15400-054
TUJ1-antibody	Covance	MMS-435P-250
Vitamin C	Sigma	A4544
Y27632	Calbiochem	CAS 146986-50-7
β-Mercaptoethanol	LifeTechnologies	21985023