Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.
Stanse av tumor suppressor protein BRCA2 og sin påvisning av vanlige biokjemiske analyser representerer en stor teknisk utfordring på grunn av den store størrelsen på den menneskelige BRCA2 protein (ca. 390 kDa). Vi rapporterer modifikasjoner av standard siRNA transfeksjon og immunoblottingforsøk protokoller for å slå human BRCA2 og detektere BRCA2 endogent protein, henholdsvis i humane epitel-cellelinjer. Viktige skritt inkluderer en høy siRNA transfeksjon reagens ratio og to påfølgende runder av siRNA transfeksjon innenfor samme eksperiment. Ved hjelp av disse og andre modifikasjoner av standard protokoll vi konsekvent oppnå mer enn 70% stanse av det humane BRCA2-genet som bedømt ved immunblotting-analyse med anti-BRCA2-antistoffer. I tillegg er denaturering av cellelysatene ved 55 ° C i stedet for den konvensjonelle 70 til 100 ° C og andre tekniske optimaliseringer av prosedyren immunoblotting tillate påvisning av intakt protein BRCA2 selv when meget lave mengder av utgangsmaterialet er tilgjengelig eller når BRCA2 protein ekspresjonsnivåer er svært lave. Effektiv stanse av BRCA2 i humane celler tilbyr en verdifull strategi for å forstyrre BRCA2 funksjon i celler med intakt BRCA2, inkludert kreftceller, for å undersøke nye molekylære stier og cellulære funksjoner som kan bli berørt av patogene BRCA2 mutasjoner i svulstene. Tilpasning av denne protokollen for effektiv lyddemping og analyse av andre 'store' proteiner som BRCA2 bør være lett oppnåelig.
Den BRCA2 (brystkreft mottakelighet gen-2) genet koder for en tumor suppressor protein som spiller en avgjørende rolle i å reparere DNA dobbelttrådbrudd ved å regulere funksjon av rekombinase enzymet Rad51 1. BRCA2 har også vært implisert i modulering av transkripsjon og i cellesykluskontroll 2. Germline mutasjoner i BRCA2 indusere en autosomal dominant mottakelighet for brystkreft og eggstokkreft hos kvinner og prostatakreft hos menn, samt predisposisjon for andre krefttyper 3,4. Men til tross for den økte risikoen i å utvikle kreft, BRCA2 mutasjoner som undertrykker eller reduserer BRCA2-funksjonen, kan gjøre kreftcellene mer sårbare for kjemoterapeutika som forårsaker DNA skade 5-7. Sporadiske kreftfremvise en lav sats av BRCA2-mutasjoner (<3%) om reduserte nivåer av BRCA2 protein har blitt oppdaget i enkelte krefttyper, som tyder på at BRCA2 proteinkan gå tapt under tumorigenesis i sporadiske kreft gjennom ikke-mutasjons-avhengige mekanismer 7,8. Derfor er det viktig å forstå BRCA2 funksjoner i sammenheng med kreft biologi, så vel som i andre biologiske innstillinger.
Et kraftig verktøy som brukes til å identifisere nye funksjoner av et gen i pattedyrceller er å dempe dens ekspresjon. Som et eksempel har tie BRCA2 uttrykk i en rekke normale epitelceller nylig førte til identifisering av en roman funksjon av BRCA2 som regulator av anoikis motstand, et viktig skritt i løpet av oppkjøpet av kreftcelle invasiv og metastatisk evne 9. Gene stanse kan oppnås ved å innføre i cellene enten små interfererende (si) RNA eller kort hårnål (sh) RNA-molekyler som er målrettet mot spesifikke genet. Den kraftige effekten av siRNA og dets brukervennlighet gjør det fortrinnsrett verktøy for å kneble eksperimenter som tar sikte på å få ny innsikt i kritiske biologiske prosesser ennd til å identifisere nye terapeutiske mål. Imidlertid kan effektiv knockdown av genekspresjon ikke være lett oppnåelig for alle genene, og kan være meget variabel, avhengig av celletype. Fordi en reduksjon i intracellulært protein nivåer er den mest relevante fenotype under undersøkelse, er det viktig å kvantifisere genet Slå ved immuno-analyse av genproduktet. Med denne respekt, presenterer BRCA2 protein en ytterligere utfordring: å være et stort protein (ca 390 kDa), gjør tekniske problemer eksisterer for konvensjonell biokjemisk analyse, inkludert immunoblotting.
Vi rapporterer her en protokoll optimalisert for effektiv lyddemping av BRCA2 i humane epiteliale cellelinjer og for rask og vellykket påvisning av BRCA2 protein knockdown ved immunoblotting analyse.
Fordi germline mutasjoner av BRCA2-genet fører til økt risiko for flere krefttyper, inkludert kvinnelig og mannlig brystkreft, eggstokkreft, prostatakreft, kreft i bukspyttkjertelen, og føflekkreft 3,4, en rekke studier har blitt gjennomført for å forstå den biologiske funksjonen av BRCA2 protein. De fleste av disse studiene er genetisk basert hovedsakelig på grunn av tekniske problemer i å analysere et gigantisk protein som BRCA2. Metoden som beskrives her for lyddemping og analyse av BRCA2 …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.
BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1000 dilution |
Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |