Stanse av<em> BRCA2</em> For å identifisere Novel BRCA2-regulert biologiske funksjoner i dyrkede humane celler

Summary

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Abstract

Stanse av tumor suppressor protein BRCA2 og sin påvisning av vanlige biokjemiske analyser representerer en stor teknisk utfordring på grunn av den store størrelsen på den menneskelige BRCA2 protein (ca. 390 kDa). Vi rapporterer modifikasjoner av standard siRNA transfeksjon og immunoblottingforsøk protokoller for å slå human BRCA2 og detektere BRCA2 endogent protein, henholdsvis i humane epitel-cellelinjer. Viktige skritt inkluderer en høy siRNA transfeksjon reagens ratio og to påfølgende runder av siRNA transfeksjon innenfor samme eksperiment. Ved hjelp av disse og andre modifikasjoner av standard protokoll vi konsekvent oppnå mer enn 70% stanse av det humane BRCA2-genet som bedømt ved immunblotting-analyse med anti-BRCA2-antistoffer. I tillegg er denaturering av cellelysatene ved 55 ° C i stedet for den konvensjonelle 70 til 100 ° C og andre tekniske optimaliseringer av prosedyren immunoblotting tillate påvisning av intakt protein BRCA2 selv when meget lave mengder av utgangsmaterialet er tilgjengelig eller når BRCA2 protein ekspresjonsnivåer er svært lave. Effektiv stanse av BRCA2 i humane celler tilbyr en verdifull strategi for å forstyrre BRCA2 funksjon i celler med intakt BRCA2, inkludert kreftceller, for å undersøke nye molekylære stier og cellulære funksjoner som kan bli berørt av patogene BRCA2 mutasjoner i svulstene. Tilpasning av denne protokollen for effektiv lyddemping og analyse av andre 'store' proteiner som BRCA2 bør være lett oppnåelig.

Introduction

Den BRCA2 (brystkreft mottakelighet gen-2) genet koder for en tumor suppressor protein som spiller en avgjørende rolle i å reparere DNA dobbelttrådbrudd ved å regulere funksjon av rekombinase enzymet Rad51 ^1. BRCA2 har også vært implisert i modulering av transkripsjon og i cellesykluskontroll ^2. Germline mutasjoner i BRCA2 indusere en autosomal dominant mottakelighet for brystkreft og eggstokkreft hos kvinner og prostatakreft hos menn, samt predisposisjon for andre krefttyper ^3,4. Men til tross for den økte risikoen i å utvikle kreft, BRCA2 mutasjoner som undertrykker eller reduserer BRCA2-funksjonen, kan gjøre kreftcellene mer sårbare for kjemoterapeutika som forårsaker DNA skade ^5-7. Sporadiske kreftfremvise en lav sats av BRCA2-mutasjoner (<3%) om reduserte nivåer av BRCA2 protein har blitt oppdaget i enkelte krefttyper, som tyder på at BRCA2 proteinkan gå tapt under tumorigenesis i sporadiske kreft gjennom ikke-mutasjons-avhengige mekanismer ^7,8. Derfor er det viktig å forstå BRCA2 funksjoner i sammenheng med kreft biologi, så vel som i andre biologiske innstillinger.

Et kraftig verktøy som brukes til å identifisere nye funksjoner av et gen i pattedyrceller er å dempe dens ekspresjon. Som et eksempel har tie BRCA2 uttrykk i en rekke normale epitelceller nylig førte til identifisering av en roman funksjon av BRCA2 som regulator av anoikis motstand, et viktig skritt i løpet av oppkjøpet av kreftcelle invasiv og metastatisk evne ^9. Gene stanse kan oppnås ved å innføre i cellene enten små interfererende (si) RNA eller kort hårnål (sh) RNA-molekyler som er målrettet mot spesifikke genet. Den kraftige effekten av siRNA og dets brukervennlighet gjør det fortrinnsrett verktøy for å kneble eksperimenter som tar sikte på å få ny innsikt i kritiske biologiske prosesser ennd til å identifisere nye terapeutiske mål. Imidlertid kan effektiv knockdown av genekspresjon ikke være lett oppnåelig for alle genene, og kan være meget variabel, avhengig av celletype. Fordi en reduksjon i intracellulært protein nivåer er den mest relevante fenotype under undersøkelse, er det viktig å kvantifisere genet Slå ved immuno-analyse av genproduktet. Med denne respekt, presenterer BRCA2 protein en ytterligere utfordring: å være et stort protein (ca 390 kDa), gjør tekniske problemer eksisterer for konvensjonell biokjemisk analyse, inkludert immunoblotting.

Vi rapporterer her en protokoll optimalisert for effektiv lyddemping av BRCA2 i humane epiteliale cellelinjer og for rask og vellykket påvisning av BRCA2 protein knockdown ved immunoblotting analyse.

Protocol

1. Forbered siRNA løsninger Resuspender 5 nmol av kryptert (Ctrl) og 5 nmol av BRCA2 siRNA tørkede pellets i 100 pl RNase-fritt vann (slutt siRNA konsentrasjon: 50 uM). Dette er siRNA lager og må lagres ved -20 ° C i 10 mL alikvoter. Ta en prøve av 10 pl fra siRNA lager og tilsett 40 ul RNase-fritt vann for å oppnå den 10 uM siRNA arbeidsløsning. Denne fortynning må oppbevares ved -20 ° C inntil bruk. MERK: siRNA arbeidsløsning bør ikke gjennomgå frysing / tining mer enn…

Representative Results

Før du fortsetter med et biologisk / biokjemisk analyse for å undersøke effekten av BRCA2 lyddemping på cellefunksjoner, er første skritt å bekrefte spesifisiteten av taushet ved å bruke en egge siRNA (non-måls siRNA) side om side med BRCA2 siRNA (figur 1A ). Det er viktig å utføre en andre runde med siRNA transfeksjon med en høy siRNA / transfeksjon forhold for å få en høy virkningsgrad av BRCA2 demping. Faktisk, utfører bare en runde av siRNA transfeksjon eller ved hje…

Discussion

Fordi germline mutasjoner av BRCA2-genet fører til økt risiko for flere krefttyper, inkludert kvinnelig og mannlig brystkreft, eggstokkreft, prostatakreft, kreft i bukspyttkjertelen, og føflekkreft ^3,4, en rekke studier har blitt gjennomført for å forstå den biologiske funksjonen av BRCA2 protein. De fleste av disse studiene er genetisk basert hovedsakelig på grunn av tekniske problemer i å analysere et gigantisk protein som BRCA2. Metoden som beskrives her for lyddemping og analyse av BRCA2 …

Materials

BRCA2 siRNA	Dharmacon	L-003462-00	SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA	Dharmacon	D-001810-10-05	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Lipofectamine RNAiMAX Reagent	Life Technologies	13778075	Transfection Reagent
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Medium for transfection procedure
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast	Life Technologies	EA0378	Gel for protein electrophoresis
NuPAGE LDS Sample buffer	Life Technologies	NP0007	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing agent (10x)	Life Technologies	NP0004	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Antioxidant	Life Technologies	NP0005	Reagent for protein electrophoresis
HiMark Pre-stained protein standard	Life Technologies	LC5699	Prestained marker for gel electrophoresis
XCell SureLoc Mini-Cell  System	Life Technologies	EI0002	Equipment for protein electrophoresis/transfer
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Life Technologies	LA0041	Reagent for Western blotting
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Reagent for Western blotting
NuPAGE Transfer Buffer	Life Technologies	NP0006-1	Reagent for Western blotting
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8326	1:300 dilution
Beta-tubulin monoclonal antibody	Sigma Aldrich	T4026-100UL	1:1000 dilution
Skim Milk powder	Sigma Aldrich	70166	Reagent for Western blotting
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379	Reagent for Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate	Pierce Thermo Scientific	34080/34096	Chemiluminescence system
PNT1A cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	95012614	PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40
Nthy cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	90011609	Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells
Cell Proliferation Kit I (MTT)	Roche	11465007001	Kit for cell proliferation assays