Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.
Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.
Nieren halten homöostatischen Gleichgewicht für verschiedene Stoffe und Regulierung des Blutvolumens in einer Weise, die Gesamtblutdruck bestimmt. Störungen der Nierenfiltration, Resorption oder Sekretion führen zu begleiten oder pathologische Zustände, die von Hyper- oder Hypotonie, um Nierenerkrankungen im Endstadium, die schließlich erfordert Nierentransplantation beenden. Die Nieren-Filtereinheit (Glomerulus) besteht aus drei Schichten – die Kapillarendothel, Basalmembran und eine Einzelzellschicht von Epithelzellen – Podozyten, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Spaltmembran Integrität und Funktion 1 zu spielen. Dysfunktion bei permselektiven glomerulären Filter verursacht Urinverlust von Makromolekülen, wie Proteinurie. Verschiedene Mittel können die Struktur der podocytes und deren Fuß Verfahren, die die Integrität der Glomeruli Filtrationsbarriere bestimmen beeinflussen.
Die podocytes in der Aufrechterhaltung der glom beteiligtenEruli Filterfunktion. Es wurde festgestellt, dass Fehlcalcium Handhabung durch den podocyte führt zu Zellschäden und spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der verschiedenen Formen von Nephropathien 2,3. Daher ist die Entwicklung eines Modells, das für die direkte Messung der intrazellulären Calciumkonzentration Veränderungen ermöglicht wird entscheidend für die Untersuchung der Podozyten Funktion sein. Isolated Glomeruli waren zuvor in einer Vielzahl von Studien, einschließlich Messung der Albuminreflexionskoeffizient ändert 4 und Beurteilung des integralen Zellströme in den Ganzzellelektrophysiologische Patch-Clamp-Messungen 5,6 verwendet. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir das Protokoll, das die Forscher ermöglicht, intrazelluläre Calcium-Konzentration sich in Abhängigkeit von Anwendungen von pharmakologischen Mitteln zu messen, abzuschätzen Basalniveaus von Calcium in den Zellen und zu beurteilen einzelnen Calciumkanäle Aktivität. Ratometric Calciumkonzentration Messungen und Patch-Clamp-electrophysiology wurden verwendet, um Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration innerhalb des podocyte und Kanalaktivität zu bestimmen sind.
Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht die Analyse von Calcium Handhabung durch den Podozyten der Glomeruli Nagetier. Diese Technik ermöglicht die Anwendung der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Einzelkanal-Fluoreszenz ratiometrische konfokale Bildgebung. Jedoch beide Ansätze können einzeln, für sich allein verwendet werden. Das vorgeschlagene Protokoll hat mehrere relativ einfache Schritte, einschließlich 1) Nieren flush; 2) Isolierung der Glomeruli durch Differential Sieben; 3) Durchführen von Patch-Clamp-ele…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopie Experimente danken. Gregory Blass ist für kritische Korrekturlesen des Manuskripts anerkannt. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Zuschuss HL108880 und American Diabetes Association unterstützt gewähren 1-15-BS-172 (als), und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).
Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm |
Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
TEA chloride | Tocris | T2265 | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |