Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme
Summary
Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar.
Abstract
Multiciliated ependimal hücreler erişkin beyninde ventrikül sıralanıyor. Anormal işlevi veya ependim kirpikler yapısı çeşitli nörolojik defisitler ile ilişkilidir. hareketli ependim kirpikler tekniğinin ex vivo canlı görüntüleme mevcut birkaç adım takip siliyer dinamikleri ayrıntılı çalışma için izin verir. Bu adımlar şunlardır: farelere karbon dioksid ile ötenazi Toledo Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Üniversitesi protokollerine göre; bir vibratome veya keskin bıçak ile beyin kaldırma ve sagital beyin diseksiyonu ardından kraniektominin ependim kirpikler görüntülenmiştir beyin lateral ventriküller, üzerinden çok ince kesitler elde etmek. % 95 /% 5 O mevcudiyetinde 2 / CO2 karışımı, 37 ° C'de Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) / Yüksek glikoz içeren özel bir cam alt plaka beynin dilimlerin Kuluçka canlı doku tutmak esastır sırasındadeney. Kirpikler dayak bir video daha sonra yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak kaydedilir. video sonra siliyer dayak frekansı hesaplamak için kare kare analiz edilir. Bu onların siliyer dayak sıklığı ve açısına göre üç kategoriye veya tipe ependimal hücrelerin farklı sınıflandırma verir. Ayrıca, bu tekniğin ependimal hücrelerin özel hücre içi kalsiyum salınım özelliklerinin yanısıra, kalsiyum salınımlarına farmakolojik ajanların etkisi ve siliyer atan frekans karakterize etmek için yüksek hızlı flüoresan görüntüleme analizi kullanımına izin verir. Buna ek olarak, bu teknik, siliyer yapı ve siliyer protein lokalizasyonu çalışmaları için immünofloresan görüntüleme için uygundur. Bu hastalık teşhis ve fenotip çalışmalarında özellikle önemlidir. Beyin dokusu ölmek başladığında tekniğin ana sınırlama canlı hareketli kirpikler hareketinde azalma atfedilir.
Introduction
Silyum hücre dışı ortama hücre yüzeyinden uzanan duyu mikrotübül tabanlı organellerdir. "9 + 0" ya da "9 + 2" – kendi mikrotübül Kuruluşunuza bağlı olarak, kirpikler iki tip olarak kategorize edilebilir. Fonksiyonel, onların hareketliliği dayanarak, bu hareketli veya non-motil kirpikler 1 olarak kabul edilebilir. Birincil kirpikler genellikle "9 + 0" non-motil kirpikler belirtmek için kullanılan bir terimdir. Bunlar ('9' ile gösterilir), dokuz paralel çifti mikrotübülleri ve mikrotübüller merkezi çifti ('0' ile gösterilir), merkezi kılıf içinde yoktur. Ancak, embriyo lateraliteyi düzenleyen gibi düğüm kirpikler gibi bazı "9 + 0" kirpikler, 2 hareketli vardır. Diğer yandan, hareketli silia mikrotübül çifti, bir ilave merkezi çift dokuz paralel mikrotübül çifti ek olarak karakterize edilmiştir ve motilite kolaylaştırmak için dinein motor protein ile bağlantılı. Buna ek olarak, bazı "9Böyle koku cilia olarak +2 "kirpikler 3 olmayan hareketli vardır. Beyin ventriküller ve omuriliğin merkezi kanal döşeyen hücreler ependimal beyin ventriküller 4 boyunca beyin omurilik sıvısı (BOS) itmek hareketli kirpikler ile karakterizedir.
Bu yöntemin genel amacı kirpikler dinamikleri ve yapısal anomaliler hareketli okuyan kolaylaştırmaktır. Beynin sağlığı ve gelişimi ağır beyin ventriküllerin içinde BOS etkin dolaşımı bağlıdır. Örneğin, normal bir BOS akım ve sıvı dengesi normale dayak ve sırayla nöronal hücrelerin yönlü hareketini düzenleyen kritik rol oynayan ve hücre göçü 7 kök fonksiyonel ependim kirpikler 5,6 gerektirir. Böyle anormal ependim kirpikler işlevi veya hidrosefali ile ilişkili anormal BOS akışına yol açabilir yapısı, tıbbi bir durum olduğu b ventrikül BOS anormal birikimi varYağmur. Bu sonuç kafa içi basınç ve baş, konvülziyon, tünel görme ilerici genişleme ve zihinsel engelli 8 arttı neden olabilir.
Mevcut yöntemlere göre bu tekniğin avantajları üç farklı ependim hücre tiplerini bildirmek için ilk kez izin olduğunu: Ben, onların eşsiz siliyer dayak sıklığı ve açı yenerek dayanan II ve III. Bu ependimal hücreler beyin ventriküllerinde belli bölgeler içinde lokalize. Ayrıca, yaş ve alkol ve ependim hücre tiplerini veya lokalizasyonu değiştirerek üzerinde silostazolün olarak farmakolojik ajanların etkileri ependimal hücrelerin bu sınıflandırmaya önce mümkün değildi, ispat edilebilir. Silostazol, fosfodiesteraz-3 inhibitörü, AMP cAMP'yi metabolize eden bir enzimdir ve bu, aynı zamanda, hücre içi kalsiyum 9 düzenler. Yüksek hızlı floresan görüntüleme analizi kullanılarak eşsiz hücre içi görüntüleme ve niceleme veriyorependim hücrelerin kalsiyum salınımı özellikleri. Örneğin, alkol ve silostazol hem anlamlı sırayla, ependim kirpikler 10 ile beyin omurilik sıvısı volüm replasmanı bir değişikliğe yol açabilecek ependim siliyer dayak frekansı yanı sıra hücre içi kalsiyum salınımlar özellikleri, değiştirilemez. Özet olarak bu teknik, farklı kalsiyum salınım özellikleri olan ependimal hücrelerinin üç farklı tip ilk kanıt sağlamak için önemli idi.
Aşağıdaki bölümde, prosedürün ayrıntılı bir adım-adım genel doku hazırlanması ve kullanımdan yakından ilgilenerek, sağlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canlı görüntüleme ve beyin ventriküller içinde ependim kirpikler hızlı ve duyarlı bir yakın gözlem sağlayan floresan mikroskopi hem fare beyin dokusu hazırlanması için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu teknik sadece lateral ventrikül ile sınırlı değildir; diğer beyin ventriküllerde kirpikler gözlemlemek için yararlanılabilir. Bu görüntüleme tekniği bir ex vivo ortamda siliyer dayak ile BOS hareketine benzer bir canlı akışı sağlar. Ayrıca, kirpikler yönlü hareketin a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma – a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O’Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
