Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
עבודה זו מתארת את הסינתזה של אי emissive, cyclometalated עיר (III) מורכב, עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), אשר מעורר אות מהירה, חיים ארוכים זרחנית כאשר מתואם לhistidine- מכיל חלבון משותק על פני השטח של חלקיקים מגנטיים. סינתזה של Ir1, בתשואות גבוהות, היא O מלא / N וכרוך פיצול של ההורה cyclometalated עיר (III) דימר-כלורו גישור לשני שווה של מתחם solvated. כדי לאשר סגוליות, כמה חומצות אמינו נבדקו לפעילות תיאום כאשר הוסיפו לבדיקה המסונתזת, והיסטידין רק עורר תגובת אות. באמצעות BNT-השני, לחקות פפטיד קנים של הסמן הביולוגי המלריה חלבון היסטידין העשיר השני (pfHRP-II), הבדיקה אירידיום קבלה תוקף ככלי לזיהוי HRP-השני. השפעות מרווה נרשמו בטיטרציה BNT-II / Ir1 בהשוואה לL-היסטידין / Ir1, אבל אלה יוחסו למכשול ותלת הסטריplet מרווה מדינה. Biolayer אינטרפרומטריה שימשה כדי לקבוע קינטיקה של אינטראקציה של Ir1 עם BNT-השני בזמן אמת. ברגע שהמערכת הייתה מותאמת, המגבלה של זיהוי של rcHRP-השני באמצעות הבדיקה נמצאה כי 12.8 ננומטר בפתרון. כאשר חלבון זה היה משותק על פני השטח של חלקיקים מגנטיים agarose 50 מיקרומטר, המגבלה של זיהוי הייתה 14.5 ננומטר. התגובה החזקה של אות בדיקה אורגנית זה, כמו גם גמישותה של שימוש בפתרון או משותק על פני השטח, יכולה להשאיל את עצמו לכיוון מגוון רחב של יישומים, משימוש אבחון להדמיה.
תיוג colorimetric וניאון הוא שיטה חשובה לזיהוי והמעקב של מולקולות ביוכימיים ותהליכי 1,2. סמני הניאון הנפוצים ביותר הם צבעי משקל מולקולרי נמוכים אורגניים 3,4, אבל לא תמיד יש מולקולות אלה תכונות אופטיות אידיאלית. צבעי ניאון נוטים photobleaching, לעתים קרובות יש משמרות סטוקס קטנות, וייתכן שיש לי עירור חופף וספקטרום פליטה. תיוג colorimetric מושגת לעתים קרובות על ידי השימוש בתוויות האנזימטית, שיש לי אות מוגברת שימושית ב5,6 כימות immunoassay. אנזימים אלה יש גם החסרונות שלהם, כוללים רגישות, תנאי תגובה, וחיי מדף קצר מצע. מאפיינים אלה נוטים לדרוש immunoassays ושיטות תיוג חלבון צריך להיעשות בתנאים מבוקרים היטב באמצעות ריאגנטים יקרים.
מתחמי מעבר מתכת emissive נחקרו כגישה תיוג חלופית FOr זיהוי ביוכימיים. בפרט, cyclometalated עיר (III) נחקר בהקשר של דיודות אורגניות פולט אור (OLEDs) 7-9 חמצן חישת 10, קטליזה 11, וחלבון / תא מכתים 12-14. בצילום גבוה ויעילות קוונטית לעשות סוג כזה של בדיקות מועמד טוב לזיהוי biomolecule 15,16. נמצא בעבר כי cyclometalated עיר (III) מתחמים, של הצורה [עיר (C ^ N) 2 (solv) 2] +, באופן בלתי הפיך להיקשר היסטידין ולעורר תגובת אות כחולה-ירוקה 12,17. מתחמים אלה שאינם emissive במדינת solvento, אבל כאשר היסטידין מחליף את מולקולות ממס ונקשר למרכז המתכת, הם משחררים אות זרחנית עזה לאחר קרינת UV גל ארוך. אות זו מתרחשת רק לאחר החלפת יגנד, והוא התוצאה של אלקטרון מדינת שלישייה המרגיע למדינת הקרקע באמצעות ההפעלה של העברת מטען ליגנד מתכת (3 מ"ל CT) והעברה ליגנד מרוכז (3 LC) מסלולי 8,15. מתחמים אלה עלולים לשמש כבדיקות לגילוי חלבוני היסטידין עשיר.
חלבוני היסטידין עשיר ורמות הרגולציה שלהם הם חשובים במחלות רבות, לרבות שחמת כבד, סרטן, והפרעות thrombic. 18 חלבון Plasmodium falciparum היסטידין העשיר השני (pfHRP-II) בפרט הוא סמן ביולוגי תוקף היטב לזיהום טפיל מלריה. חלבון זה הוא 67 kDa ומכיל 34% היסטידין, בעיקר במוטיבי AHHAHHAAD חוזר מאפיין 19. חוזר היסטידין אלה יכולים להיקשר יונים חופשי מתכת 19 וheme קומפלקסי 20 בדם מארח. pfHRP-השני מזוהה בדרך כלל בהגדרות נמוך משאב באמצעות בדיקות immunochromatographic מהירות אבחון (RDTs), אבל בדיקות אלה הן לעתים קרובות לא מדויקות בשל תנאי מדגם, ריכוז סמן ביולוגי נמוך, תקני ייצור עניים, והשפלה נוגדן 21.
<p class="Jove_content"> בדיקות זרחניות מבוסס מתכת כגון עיר cyclometalated (III) מתחמים שתוארו לעיל הם אפשרויות אטרקטיביות לגילוי pfHRP-השני בשל כריכתם סלקטיבית של היסטידין ומאפייני סטאבילה ופליטה היעילה שלהם. במאמר זה, השימוש ב[ עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) כדי לזהות BNT-השני, לחקות פפטיד קנים של pfHRP-II הוא חקר 22. קינטיקה של אינטראקציה זו הייתה במעקב בזמן אמת תוך שימוש בטכניקות אינטרפרומטריה biolayer. Assay גם מותאם לפורמט ELISA-סוג על-חרוז, שבו גבולות של ננו-מולר של זיהוי הושגו. assay זה מחזיק יתרונות על פני ELISAs המסורתי כי זה יכול להתבצע בתחת 2 שעות עם חומרים כימיים ללא נוגדנים, במקום שעות 4-5 וריאגנטים ביולוגיים הנדרשים עם ELISAs הטיפוסי.ככלי אבחון מבוסס microparticle הגיעו לחזית טכנולוגית אבחון המודרנית, זיהוי של מולקולות ביולוגיות יעד ישירות על פני השטח של החלקיקים הוא יתרון גדול. שיטות מסורתיות מולקולריות זיהוי, כגון ELISA וPCR, הן יתרון, בכך שהם יכולים להשיג גבולות נמוכים מאוד של זיהוי 25. עם זאת, מבחני אלה דורשים חומרים כימיים נרחבים ופרוטוקולים ארוכים. assay זה נועד לחקות אינטראקציות כריך ELISA-סוג ללא הזמן ודרישות מגיב (איור 5). בנוסף, עלות הבדיקה Ir1 לדגימה הייתה מוערכת להיות סביב אגורה, ואילו העלות של נוגדנים לELISA טיפוסי היא .20-.30 $ למדגם.
מאז השיטות שתוארו לעיל מסתמכות על בדיקה אירידיום cyclometalated לגילוי של הסמן ביולוגי המלריה, בדיקה זו לא תהיה רגישה למצבי כישלון משותפים לשיטות זיהוי אחרות (כלומר. Quenchi fluorophoreng והשפלה נוגדן / אנזים). היסטידין הוא ייחודי בתכונות מחייבות המתכת שלה. העבודה המתוארת מנצלת תופעה זו על ידי החלפת הנוגדנים בכריך ELISA טיפוסי עם מתחמים המכילים מתכת. Ni (II) נת"ע לוכד rcHRP-II על פני השטח של החלקיקים וIr1 מסמן את הנוכחות של החלבון. השלב הקריטי ביותר בassay מאפשר חלקיקים המגנטיים לערבב עם המדגם והבדיקה. בצלחת ELISA 96-היטב, מולקולות ביולוגיות וחומרים כימיים להגיע לשיווי משקל עם המשטח דו ממדים של תחתית הבאר. יש חלקיקים מגנטיים הנטייה להתיישב מחוץ לפתרון בשל הליבה שלהם הצפופה תחמוצת ברזל, שתפחית את אתרי קישור הזמינים. כך, החלקיקים חייבים להיות מעורבים בזמן assay כדי להבטיח מקסימאלי מחייב.
בעת תכנון מגיב לאבחון מחלה, יש לזכור צורה של מדגם מטופל, כמו גם את הריכוז הפיזיולוגי של הסמן הביולוגי. למלריה, הריכוז של PF HRP-השני בדם של חולה יכול להשתנות מpicomolar הנמוך עד גבוה של ננו-מולר. בעוד assay זה רלוונטי מבחינה קלינית לרמות גבוהות יותר של זיהום, המגבלה של זיהוי צריכה להיות משופרת על מנת לזהות חולים ללא תסמינים עם picomolar הנמוך במחזור PF HRP-השני. בשיטות שתוארו לעיל, "לעבור על" אות שנוצרה על ידי Ir1 מתרחשת בנוכחות של היסטידין. בעוד הסמן הביולוגי המלריה הוא עשיר בהיסטידין, חלבונים בסרום אחרים, כגון אלבומין בסרום אדם וגליקופרוטאין העשיר היסטידין, היו לעורר תגובת אות עם החללית. זה היה בתורו יוביל לאבחון חיובי שגוי. זה הופך את לכידתו של החלבון על פני השטח של חלקיקי צעד מועיל, שבחלבון של עניין ניתן לחלץ במהירות ממדגם מטופל. בנוסף, עיצוב חללית bifunctional, שזוגות פפטיד העשיר היסטידין לאלמנט הכרה מולקולרית חזק (כלומר. Aptamer), יכול להוסיף שכבה נוספת של סגוליות לassay. הפפטיד יהיה עמוס אירידיום לפני הצימוד לaptamer. בעיצוב כזה, הבדיקה Ir1 היציבה עדיין יכולה להיות מנוצלת תוך השגת היעד ספציפי עם aptamer. זה היה מאפשר ליישום של החללית כדי לזהות HRP-השני ילידים במטריצה מורכבת (כלומר. פלזמה או כל דם) ולהפחית את תופעות מחייבות שאינם ספציפיות. על מנת לשפר את האות של בדיקות אבחון מהירות יותר, assay יכול להיות משולב בתוך מערכת electrochemiluminescent (ECL), שבו ניתן לאתר PF HRP-השני בRDTs כקריאת נתונים אלקטרוכימיים 26. הבדיקה אירידיום הדור הבאה זה יהיה מאוד לשפר assay ELISA שלנו על-חרוז לגילוי של סמנים ביולוגיים למחלות.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |