Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Dette arbeid beskriver syntesen av et ikke-emitterende, cyclometalated Ir (III) kompleks, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), som frembringer en rask, lang levetid fosfor signal når koordinert til et histidine- inneholdende protein immobilisert på overflaten av en magnetisk partikkel. Syntese av IR1, i høye utbytter, er komplett O / N og omfatter splitting av moder cyclometalated Ir (III) klor-brodannede dimer til to ekvivalenter av solvatisert kompleks. For å bekrefte spesifisiteten ble flere aminosyrer probet for koordinering aktivitet når de tilsettes til det syntetiserte probe, og bare histidin fremkalte en signalrespons. Bruke BNT-II, en forgrenet peptid mimikken i malaria biomarkør Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), ble iridium probe validert som et verktøy for HRP-II gjenkjenning. Slukkings effekter ble bemerket i BNT-II / IR1 titrering i forhold til L-histidin / IR1, men disse ble tilskrevet sterisk hindring og triPlet tilstand slukke. Biolag interferometri ble anvendt for å bestemme sanntidskinetikken for interaksjon av IR1 med BNT-II. Når systemet er optimalisert, er grensen for påvisning av rcHRP-II ved bruk av probe funnet å være 12,8 nM i oppløsning. Når dette protein ble immobilisert på overflaten av en 50 um agarose magnetisk partikkel, deteksjonsgrense var 14,5 nM. Den robuste signalrespons på denne uorganiske probe, så vel som dens fleksibilitet for bruk i løsning eller immobilisert på en overflate, kan egner seg mot en rekke anvendelser, fra diagnostisk bruk til avbildning.
Colorimetric og fluorescerende merking er en viktig metode for deteksjon og sporing av biokjemiske molekyler og prosesser 1,2. De mest vanlige fluorescerende markører er lav molekylvekt, organiske fargestoffer som 3,4, men disse molekylene ikke alltid har ideelle optiske egenskaper. Fluorescerende fargestoffer er utsatt for fotobleking, ofte har små Stokes skift, og kan ha overlappende eksitasjon og emisjonsspektra. Colorimetric merking oppnås ofte ved bruk av enzymatiske etiketter, som har et forsterket signal anvendelig ved immunologisk kvantifisering 5,6. Disse enzymer har også sine ulemper, inkludert foto, reaksjonsbetingelser, og korte substrat holdbarhet. Disse egenskaper har en tendens til å kreve immunologiske analyser og proteinmerkingsmetoder for å gjøres under godt kontrollerte betingelser ved anvendelse av kostbare reagenser.
Utslippsovergangsmetallkomplekser har blitt utforsket som et alternativ merking tilnærming for biokjemisk deteksjon. Spesielt cyclometalated Ir (III) har blitt studert i sammenheng med organic light emitting diodes (OLED) 7-9 oksygen sensing 10, kata 11, og protein / celle flekker 12-14. Høy fotostabilitet og kvantevirkningsgraden gjøre denne klassen av sonder en god kandidat for biomolekyl deteksjon 15,16. Det ble tidligere funnet at cyclometalated Ir (III) komplekser, på formen [Ir (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, irreversibelt binde histidin og lokke fram en blå-grønt signal respons 12,17. Disse kompleksene er ikke emisjons i solvento staten, men når histidin fortrenger de løsemiddel molekyler og binder seg til metallet sentrum, de slipper en intens fosforiser signal etter langbølget UV-bestråling. Dette signalet bare opptrer etter ligand substitusjon, og er resultatet av en triplet tilstand elektron avslappende til grunntilstanden ved aktivering av metall ligand ladningsoverføring (3 MLCT) og ligand sentrert transfer (3 LC) trasé 8,15. Disse komplekser kan potensielt brukes som prober for deteksjon Histidinrike proteiner.
Histidinrike proteiner og deres reguleringsnivåer er viktig i mange sykdommer, inkludert levercirrhose, kreft og thrombic lidelser. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) er spesielt et godt validert biomarkør for malariaparasitten infeksjon. Dette proteinet er 67 kDa og inneholder 34% histidin, for det meste innen karakteristiske AHHAHHAAD gjenta motiver 19. Disse histidin repetisjoner kan binde frie metallioner 19 og heme komplekser 20 i verts blod. pfHRP-II er ofte påvist i lav ressursinnstillingene ved hjelp Immunokromatografisk rask diagnostiske tester (RDTs), men disse testene er ofte unøyaktig på grunn av prøve forhold, lav biomarkør konsentrasjon, dårlig produksjon standarder, og antistoff degradering 21.
<p class="Jove_content"> metallbaserte fosforescerende prober som cyclometalated Ir (III) komplekser som er beskrevet ovenfor, er attraktive muligheter for påvisning av pfHRP-II på grunn av deres selektive binding av histidin og deres stabile og effektive emisjonsegenskaper. I denne utredningen, bruk av [Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2] + (IR1) for å oppdage BNT-II, en forgrenet peptid ligner av pfHRP-II utforskes 22. Kinetics av denne interaksjonen ble overvåket i sanntid ved hjelp biolag interferometriteknikker. Analysen ble også tilpasset til en på vulst ELISA-type format, hvor nanomolare påvisningsgrenser ble oppnådd. Denne analysen har fordeler sammenlignet med tradisjonelle ELISA-er, fordi den kan utføres i henhold til to timer med antistoff-frie reagenser, i stedet for 4-5 timer og biologiske reagenser som er nødvendig med vanlige ELISA.Som mikropartikkelbaserte diagnostiske verktøy kommer i forkant av moderne diagnostisk teknologi, er påvisning av målet biomolekyler direkte på overflaten av partikkelen en stor fordel. Tradisjonelle molekylære påvisningsmetoder, så som ELISA og PCR, er fordelaktige ved at de kan oppnå meget lave påvisningsgrense 25. Men disse analysene krever omfattende reagenser og lange protokoller. Denne analysen er designet for å etterligne ELISA-typen sandwich interaksjoner uten tid og krav reagens (figur 5). I tillegg ble kostnaden av IR1 sonde per prøve antatt å være omtrent en krone, mens kostnadene for antistoffer for en typisk ELISA er 0,20 til 0,30 $ per prøve.
Siden de ovenfor beskrevne metoder er avhengige av en cyclometalated iridium probe for påvisning av malaria biomarkør, vil denne proben ikke være utsatt for feilmodi er felles med andre påvisningsmetoder (f.eks. Fluoroforen quenching og antistoff / enzym nedbrytning). Histidin er unik i sin metallbindende egenskaper. Den skisserte Arbeidet tar fordel av dette fenomen ved å erstatte antistoffene i en typisk sandwich-ELISA med metallholdige komplekser. Ni (II) NTA fanger rcHRP-II på overflaten av partikkelen og IR1 signaler nærvær av proteinet. Den mest kritiske trinn i analysen er slik at de magnetiske partiklene til å blande seg med prøven og sonden. I en 96-brønns plate ELISA, den biomolekyler og reagenser nå likevekt med det todimensjonale flate av bunnen av brønnen. Magnetiske partikler har tendens til å felles ut av oppløsningen på grunn av deres tette jern-oksid kjernen, noe som ville redusere de tilgjengelige bindingssteder. Således må partiklene blandes i løpet av analysetiden for å sikre maksimal binding.
Når du utformer en reagent for sykdomsdiagnose, må man huske på form av pasientprøve samt fysiologiske konsentrasjon av biomarkør. Formalaria, kan konsentrasjonen av pf HRP-II i en pasients blod varierer fra lav til høy picomolar nanomolar. Selv om denne analysen er klinisk relevant for høyere nivåer av infeksjon, må deteksjonsgrensen for å bli bedre for å påvise asymptomatiske pasienter med lav picomolar sirkulerende pf HRP-II. I de fremgangsmåter som er skissert ovenfor, er "slå-på" signal genereres av IR1 forekommer i nærvær av histidin. Mens malarial biomarkør er rik på histidin, andre serumproteiner, så som humant serum albumin og histidin rik glykoprotein, vil fremkalle et signal reaksjon med proben. Dette vil i sin tur føre til falske positive diagnoser. Dette gjør fangst av proteinet på overflaten av partikkelen en gunstig trinn, ved at proteinet av interesse kan bli hurtig trukket ut fra en pasientprøve. I tillegg utforme et bifunksjonelt sonde, som par en histidin rik peptid til en robust molekylær anerkjennelse element (ie. Aptamer), Kan legge et lag av spesifisitet for metoden. Peptidet kan være lastet med iridium før kobling til aptamer. I en slik utforming, kan den stabile IR1 sonden fremdeles bli benyttet samtidig oppnå målet spesifisitet med aptamer. Dette ville muliggjøre anvendelse av sonden for å detektere naturlig HRP-II i et kompleks matrise (ie. Plasma eller helblod) og redusere ikke-spesifikke bindingseffekter. For ytterligere å forsterke signalet til rask diagnostiske tester, kan analysen bli innarbeidet i en elektrokjemiluminescensmarkør (ECL) system, hvor pf HRP-II kan detekteres på RDTs som en elektrokjemisk 26 avlesning. Denne neste generasjon iridium sonde vil kraftig forbedre vår on-perle ELISA-analysen for påvisning av sykdoms biomarkører.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |