순환 종양 세포(CTC)는 종양 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 간세포 암종(HCC) 전이의 syngeneic mouse tumor model의 전혈에서 CTC를 분리 및 증식하는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
암 전이는 암 관련 사망의 가장 큰 원인입니다. 최근 연구에 따르면 순환 종양 세포(CTC)가 암 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 실제로, CTC의 수는 종양 크기와 상관관계가 있습니다. 여기에서는 간세포 암종(HCC)의 syngeneic mouse model에서 CTC를 분리 및 증식하는 방법론에 대한 자세한 설명을 제공하며, 이를 통해 고형 장기 종양 전이의 잠재적으로 중요한 분자 메커니즘에 대한 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 효율적이고 재현 가능합니다. 이는 비침습적 기술이므로 합병증과 관련될 수 있는 인간 조직의 침습적 생검을 대체할 수 있는 잠재력이 있습니다. 따라서 여기에서 논의된 방법은 전혈 샘플에서 CTC를 분리 및 증식하여 검사하고 특성화할 수 있습니다. 이는 진단 및 맞춤형 표적 치료와 같은 임상 응용 분야에 대한 향후 적응 가능성이 있습니다.
서론
암 연구계는 1869년 토마스 애시워스(Thomas Ashworth)에 의해 처음 관찰된 이래로 순환 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)의 존재를 알고 있었다1. 그 이후로 CTC는 종양 전이 및 질병 진행2-5에 중요한 것으로 나타났습니다. 오늘날 고형 종양은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. CTC는 원발성 종양에서 유래하여 혈류를 통해 다른 장기로 이동하는 희귀 세포로, 그 중 극히 일부만이 궁극적으로전이 2-5로 발전합니다. 특히 종양 크기와 CTC 번호3,4 사이에는 양의 상관관계가 있습니다.
CTC 생물학에 대한 이해는 표적 치료법을 찾는 데 기여할 수 있습니다. 또한 CTC에는 진단 응용 프로그램이 있을 수 있습니다. 이러한 잠재적인 임상 응용 프로그램을 달성하려면 CTC 연구와 관련된 몇 가지 현재 과제를 극복해야 합니다. 한 가지 문제는 CTC가 단일 세포 또는 클러스터로 존재할 수 있으며 혈액 미세환경2에 대한 반응으로 표현형을 변경할 수도 있다는 사실과 관련이 있습니다. 더욱이, 혈액 10억 개당 10억 개의 혈액 세포 중 CTC의 수가 적기 때문에(밀리리터당 수백 개) 검출이 매우....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리 선언문 : 모든 동물 실험은 뉴욕 시립 대학의 헌터 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 사전 실험 절차
- 동물 시설에 도착하면, 처음에 필터링 상단과 우드 칩 침구와 케이지에 3 BALB / c 마우스를 수용. 쥐가 음식, 퓨리나 설치류 우, 물을 무료로 이용하실 수 있습니다 있는지 확인합니다. 케이지가 일주일에 한 번 청소해야합니다 동안 침구와 음식은 일주일에 두 번 변경해야합니다.
- 분당 1 L의 일정한 유속으로 산소와 함께 기화기 이소 플루 란을 이용하여 마우스의 전신 마취를 유도한다. 이 시스템은 자립하고 정밀 기화기를 포함한다.
- 연결된 정밀 기화기와 가스 / 마취제 시스템을 갖는 플라스틱 상자에 위치 동물. 동물이 시점에서 2 기화기을 절감, 의식이 될 때까지 처음에 2.5 기화기를 설정합니다.
- 이 때, 스위치밸브 라인, 박스로 밀봉하고 노즈콘에 개방.
- 노우즈 콘 (유지 마취)의 설치 위치와 접속하여, 준비 공간에 동물을 이동.
- 마우스 당 주입 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 마우스의 간세포 암 세포를 준비합니다. BNL 1ME A.7R.1 매체에서 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기서 설명한 방법론은 CTCS가 분리 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 마우스는 인도적 실험 엔드 포인트에서 안락사시켰다. 프로세스 관련 이산화탄소 질식, 심장 내 방혈 및 경추 탈구. 과정의 주요 단계를 개략적으로는도 2에 도시되어있다. 내부 - 심장 방혈로 수집 전혈 시료는 전술 프로토콜을 이용하여 처리 하였다. 그 후, 원심 분리 RBC 용해시켰다 버피 코트 층을 결정하는데 사용 하였다. 이 후 PBS로 세척 하였다 백탁 펠렛을 수집하는 또 다른 원심 분리 단계에 이어, 세포 배양에서 전파 완전한 세포 배양 배지에 재현 탁 하였다. 올 수있는 문제가 얻어 펠렛은 색상이 명확하지 않을 수 있습니다. 이를 추가 시간을 행하여 아마도 15 분, 또는 -이 문제는 쉽게 10로 증가시켜 적혈구 용해 완충액에서 배양 시간을 변경함으로써 해결 될 수있다.BNL 1ME A.7R.1의 세포에 비해 세 가지 다른 생쥐는도 1에 도시되어 CTCS에서의 대표적인 이미지는 배양으로 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
본 연구에서는 간세포암종이 있는 동계 마우스의 전혈에서 CTC를 분리하고 증식시키는 방법을 설명하였다. 이 작업의 목적은 암 전이 메커니즘에 대한 진행 중인 연구를 강화하는 것입니다.
많은 암의 예후가 좋지 않은 요인은 적시에 발견되지 않고 그에 따른 악성 종양의 광범위한 전파입니다3. CTC는 원발성 암에서 발생하며 혈류를 통해 먼 장기로 퍼집니다. 이와 같이, CTC는 암 전이에 중요하며 진단3,9,10과 같은 여러 임상 적용의 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 CTC가 췌장암, 전립선암, 유방암 등 다양한 암 유형에서 질병의 진행과 강한 상관관계가 있음을 보여주는 여러 임상 연구의 데이터에 의해 뒷받침됩니다3,11,12. CTC가 암 진단에 매우 유용할 수 있다는 사실에도 불구하고 수십억 개의 혈액 세포 중 극소수가 존재하기 때문에 CTC를 분리하고 특성화하는 것은 어렵습니다3,7.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
Ogunwobi 박사의 연구실은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 산하 MD007599(National Institute on Minority Health and Health Disparities)의 소수 민족 기관 연구 센터 프로그램(Research Centers in Minority Institutions Program) 보조금으로 지원됩니다. 이 원고의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIHMD 또는 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 헤파린 나트륨 소금 1 g | VWR | 89508-852 | |
| BTX 튜브 마이크로 1.5 ml 투명 NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf 튜브 |
| 바늘 멸균 Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G 바늘 |
| Slp 팁 SRNG 1 ml 팩당 200 | VWR | BD309659 | 1 ml 주사기 팁 |
| 주사기 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml 주사기 |
| VWR 포셉트 티슈 6 | VWR | 82027-446 | 포셉스 |
| Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
| Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
| VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 VWR | 48311-703 | Slides | |
| VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | 커버 유리 |
| VWR 슬라이드 박스 트루 노스 FM Pu | VWR | 89140-278 | 슬라이드 박스 |
| Super HT PAP 펜 | VWR | 89427-058 | PAP 펜 |
| 물 RNASe 및 DNAse 무료 2 L | VWR | 101454-204 | 뉴클레아제 무료 물 |
| 버퍼 트리스 초순수 등급 500 g | VWR | 97061-796 | 트리스 버퍼 |
| 염화 암모늄 ACS 등급 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | 염화암모늄 완충액 |
| 팔콘 조직 배양 접시 60 x 15 mm 스타일 폴리스티렌 | VWR | 353002 | 조직 배양 접시 |
| Clorox 살균 표백제, 일반 | VWR | 89501-620 | Clorox 표백제 |
| PBS, 칼슘 및 마그네슘 없는 1x(인산염 완충 식염수)(500ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
| DMEM, 1x 4.5 g/L 포도당으로 & 피루브산나트륨이 없는 L-글루타민 | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM BNL 1ME A.7R.1 세포용 1x 배지 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
| 페니실린 스트렙토마이신 용액, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | 페니실린 스트렙토마이신 |
| Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000rpm 원심분리기 |
참고문헌
- Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
- van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: W....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
