שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
חלבוני התנגדות Myxovirus (MX) הם חלק חשוב של ההגנה החיסונית המולדת נגד פתוגנים נגיפיים. חלבונים אלה הם GTPases כמו dynamin-גדול הנגרמים על ידי הסוג I וסוג III אינטרפרונים. גני Mx המקבילים נמצאים כמעט בכל בעלי חוליות בעותקים אחד או מספר המוצרים והגן לעכב מגוון רחב של וירוסים, כולל Orthomyxoviridae (למשל., וירוס שפעת), Rhabdoviridae (למשל., וירוס stomatitis שלפוחי), Bunyaviridae (למשל. , וירוס LA CROSSE) וRetroviridae (למשל, וירוס כשל חיסוני אנושי-1) 1-4. לא ברור כיצד חלבונים אלה להכיר מגוון רחב כל כך של וירוסים, ללא כל רצף ראשוני משותף לכאורה מוטיבים בוירוסים אלה. ניתוח האינטראקציה של חלבוני MX עם המטרות נגיפיות שלהם, שעלול להיות כרוכות במתחמים מסדר גבוהים יותר עם גורמי תא מארח אחרים, יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים tכובע התפתח במרוץ החימוש בין וירוסים ומארחיהם.
האינטראקציה בין חלבוני Mx יונקים ומטרות נגיפיות נחקרה בצורה נרחבת ביותר לMXA האנושי. MXA האדם יכול לעכב את השכפול של וירוסים רבים, כוללים שפעת orthomyxoviruses ווירוס Thogoto. MXA נקשר מתחמי Thogoto ribonucleoprotein הווירוס (vRNPs), ובכך למנוע הכניסה הגרעינית שלהם, וכתוצאה מכך הבלוק של זיהום 5. אינטראקציה זו בין vRNPs וירוס MXA וThogoto הודגמה בניסויי שיתוף שקיעה ושיתוף immunoprecipitation 6-9. איך חלבוני Mx לעכב נגיפי שפעת הוא פחות ברור. אחת בעיות עיקריות הוא שזה לא פשוט להפגין אינטראקציה בין חלבון מושלם וזה מוצר גן השפעת. דו"ח אחד הפגין אינטראקציה בין MXA אדם וחלבון NP בשפעת תאים נגועים בוירוס 10. אינטראקציה זו יכולה להיות מוצגת רק על ידי שיתוף immunoprecipitation אם טופלו התאים עם dithiobis cross-linking מגיב (propionate succinimidyl) לפני תמוגה, המצביע על כך האינטראקציה היא חולפת ו / או חלשה. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי רגישות Mx ההפרש של זני שפעת שונים נקבעת על ידי המקור של חלבון NP 11,12. בקנה אחד עם זו, נגיפי שפעת יכולים לברוח בחלק משליטת Mx על ידי מוטציה שאריות ספציפיות בחלבון NP 13. הדבר מצביע על כך היעד העיקרי של וירוסי שפעת למארח MX הוא חלבון NP, ככל הנראה NP התאסף במתחמי vRNP. עם זאת, אף אחד מהמחקרים שנעשה לאחרונה הראה יותר אלה אינטראקציה בין השפעת NP או vRNPs וגם MXA אדם או לעכבר MX1.
לאחרונה הראו, בפעם הראשונה, אינטראקציה בין השפעת NP וחלבון MX1 עכבר עם פרוטוקול מותאם שיתוף immunoprecipitation 14, שתואר כאן בהרחבה. בשיתוף i הכללית,mmunoprecipitation הוא אחת הגישות הנפוצות ביותר בשימוש ביוכימיים לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. טכניקה זו לעתים קרובות עדיפה על טכניקות חלופיות, למשל, שמרי שתי היברידיים, שכן הוא מאפשר לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בסביבתם הטבעית. Co-immunoprecipitation יכול להתבצע על חלבונים הביעו endogenously אם נוגדנים נגד חלבוני עניין זמינים. לחלופין, חלבוני עניין יכולים לבוא לידי ביטוי בתא דרך transfection או זיהום ותג זיקה ניתן להשתמש. בנוסף ליתרונות שהוזכר לעיל, פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation המתואר מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון חלשות ו / או חולפות. המרכיב העיקרי בפרוטוקול מותאם זה הוא התוספת של N-ethylmaleimide (Nem) במאגר תמוגה התא. Nem הוא מגיב אלקילציה שמגיבה עם קבוצות תיאול חופשיות כמו הווה בcysteines, בpH של 6.5-7.5, כדי ליצור thio-אסתר יציבה(איור 1). ב- pH גבוה יותר, nem יכול גם להגיב עם קבוצות אמינו או לעבור הידרוליזה 15. Nem משמש בדרך כלל כדי לחסום קבוצות תיאול חופשיות, על מנת למנוע היווצרות קשר דיסולפיד או לעכב פעילות האנזימטית. לדוגמא, nem משמש לעתים קרובות כדי לחסום אנזימי desumoylating, אשר פרוטאזות ציסטאין. בפרוטוקול שיתוף immunoprecipitation תאר, nem תחילה כלול במאגר תמוגה משום שכבר דווחו כי sumoylation של חלבוני שפעת יכולה להשפיע על האינטראקציה בין חלבונים נגיפיים 16. באופן בלתי צפוי, התוספת של nem הוכיחה להיות מפתח ללתעד את האינטראקציה בין השפעת NP ועכבר MX1 על ידי שיתוף immunoprecipitation. לא ברור מדוע התוספת של nem היא חיונית כדי לזהות את האינטראקציה NP-MX1. אולי האינטראקציה מדי חולפת ו / או חלשה. Nem יכול לייצב את האינטראקציה, למשל, על ידי שמירת קונפורמציה ספציפית של MX1, חלבון נגיפי או אפילו compo שלישי לא ידועnent. כגון השפעה מייצבת של nem נצפתה לפני, למשל, לאינטראקציה בין reductase ribonucleotide M1 וgemcitabine המעכב (F2dC) 17. MX1 וNP שניהם מכילים שאריות ציסטאין מרובות אשר יכול להיות שונה על ידי nem. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה על ידי רני et al. הוכיח כי stalkless MXA-variant מכיל שלוש שאריות ציסטאין נחשפו ממס שניתן לשנות על ידי iodoacetamide. מוטציה שאריות אלה לserines לא השפיעה על הפעילות האנזימטית של MXA, אבל מנעה צבירה בתיווך דיסולפיד 18. כcysteines אלה נשמרים בMX1, זה מצביע על כך cysteines המקביל בMX1 ניתן לשנות על ידי nem וכקונפורמציה השפעה כזו או מסיסות. בנוסף, nem עשוי להשפיע גם על פעילות GTPase של MX1, שהוא חיוני לפעילות נגד השפעת של MX1, ובכך לייצב את יחסי הגומלין בין MX1 וNP. עם זאת, השפעה ישירה של nem על acti GTPasevity של MX1 הוא סביר, כnem נדרש גם כדי לזהות את יחסי הגומלין בין השפעת NP וGTPase מוטציות לא פעילה של חלבון MX1 14. ברור, יש צורך במחקר נוסף כדי לפענח את ההשפעה של nem על האינטראקציה NP-MX1.
לסיכום, פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation המתואר מאפשר לחקור את האינטראקציה בין החלבונים אנטי MX1 והיעד הנגיפי שלה, חלבון NP שפעת. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור אינטראקציות חלשות או חולפות אחרות שתלויים בייצוב של תצורות חלבון ספציפיות. אינטראקציה בין חלבונים התלויים בתצורות ספציפיות תוארה קודם לכן, למשל, למחייב חלבוני סידן כגון calmodulin 19. לבסוף, התפקיד מועיל של nem יכול לשמש גם בשיטות אחרות המזהות חלבונים אינטראקציות, כגון מבחני שיתוף שקיעה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לומד את האינטראקציה בין חלבונים אנטי ויראלי והמטרות שלהם הוא מאוד חשוב להבין את פרטי המנגנון אנטי של החלבונים האלה. זה יכול לתת לי תובנות חדשות על איך וירוסים ומארחיהם התפתחו יחד ולהיות הבסיס לפיתוח אסטרטגיות אנטי חדשות. פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation מותאם המתואר כאן מא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי FWO-Vlaanderen, פרויקט צבא IOF10 / StarTT / 027 ואוניברסיטת גנט מיוחדת מענק מחקר BOF12 / גואה / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
References
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
- Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
- Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
- Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
- Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
- Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
- Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
- Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
- Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
- Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
- Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).
- Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
- Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
- Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
- Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
- Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).
