شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
مقاومة فيروس مخاطي (MX) البروتينات تعد جزءا هاما من الدفاع المناعي الفطري ضد مسببات الأمراض الفيروسية. هذه البروتينات هي GTPases مثل dynamin الكبيرة التي يتم الناجمة عن النوع الأول والنوع الثالث إنترفيرون. المقابلة الجينات الإرسال المتعدد موجودة في جميع الفقاريات تقريبا في واحدة أو عدة نسخ والمنتجات الجينات، تمنع مجموعة واسعة من الفيروسات، بما في ذلك فيروسات مخاطية قويمة (على سبيل المثال، فيروس الأنفلونزا)، فيروسات ربدية (على سبيل المثال، فيروس التهاب الفم الحويصلي)، الفيروسات البنياوية (على سبيل المثال. ، LA فيروس اكروس) وRetroviridae (على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1-4. ومن غير الواضح كيف تعترف هذه البروتينات مثل مجموعة واسعة من الفيروسات، من دون أي تسلسل الأساسي المشترك واضح الزخارف في هذه الفيروسات. تحليل تفاعل البروتينات الإرسال المتعدد مع أهدافها الفيروسية، ويحتمل أن تنطوي على المجمعات أجل أعلى مع العوامل الخلية المضيفة الأخرى، سوف تساعد على فهم الآليات الجزيئية روقد تطورت قبعة في سباق التسلح بين الفيروسات ومضيفيهم.
وقد تمت دراسة التفاعل بين البروتينات الإرسال المتعدد في الثدييات والأهداف الفيروسية الأكثر نطاق واسع لMXA البشري. MXA الإنسان يمكن أن تحول دون تكرار العديد من الفيروسات، بما في ذلك orthomyxoviruses الأنفلونزا وفيروس Thogoto. MXA يربط Thogoto المجمعات بروتين نووي ريبوزي فيروس (vRNPs)، وبالتالي منع دخولهم النووي، مما يؤدي إلى كتلة من العدوى 5. وقد تجلى هذا التفاعل بين MXA وThogoto vRNPs فيروس مع زملاء الترسيب وشارك في مناعي التجارب 6-9. كيف تعيق البروتينات الإرسال المتعدد فيروسات الأنفلونزا A غير أقل وضوحا. واحد المشكلة الرئيسية هي أنه ليس واضحة لإثبات وجود التفاعل بين البروتين الإرسال المتعدد ومنتج الجين الأنفلونزا. أظهر تقرير واحد تفاعل بين MXA البشري والبروتين NP في الأنفلونزا A خلايا الفيروس 10. يمكن أن يظهر هذا التفاعل إلا من خلال التعاون immunoprecipitation إذا كان قد تعامل الخلايا مع ربط عبر dithiobis كاشف (succinimidyl بروبيونات) قبل تحلل، مما يدل على أن التفاعل هو عابر و / أو ضعيف. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الفرق الإرسال المتعدد حساسية مختلفة سلالات الأنفلونزا A يتم تحديد من أصل البروتين NP 11،12. وتماشيا مع هذا، يمكن أن فيروسات الأنفلونزا A الهروب جزئيا من سيطرة الإرسال المتعدد التي تحور بقايا محددة في البروتين NP 13. وهذا يشير إلى أن الهدف الرئيسي من فيروسات الإنفلونزا A للمضيف MX هو البروتين NP، على الأرجح NP تجميعها في مجمعات vRNP. ومع ذلك، فإن أيا من هذه الدراسات الأخيرة أظهرت وجود أكثر التفاعل بين NP الإنفلونزا أو vRNPs وإما MXA البشري أو الماوس MX1.
أظهرنا مؤخرا، لأول مرة، وهو التفاعل بين أنفلونزا NP والبروتين MX1 الماوس مع الأمثل بروتوكول التعاون مناعي 14، الذي يوصف هنا بالتفصيل. في العام، وشارك في طmmunoprecipitation هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية الأكثر استخداما للتحقيق تفاعلات البروتين البروتين. وغالبا ما يفضل هذه التقنية على تقنيات بديلة، على سبيل المثال، الخميرة اثنين الهجين، لأنه يسمح للتحقيق في التفاعلات البروتين البروتين في بيئتها الطبيعية. يمكن أن يتم التعاون مناعي خارجا على البروتينات وأعرب التطور الطبيعي إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتينات ذات الاهتمام المتاحة. بدلا من ذلك، البروتينات من الفائدة يمكن التعبير في الخلية من خلال ترنسفكأيشن أو العدوى، ويمكن استخدامه علامة التقارب. وبالإضافة إلى المزايا المذكورة أعلاه، وبروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح للكشف عن ضعف و / أو عابرة تفاعلات البروتين. المكون الرئيسي في هذا البروتوكول الأمثل هو إضافة N-ethylmaleimide (NEM) في المخزن المؤقت تحلل الخلية. NEM هو كاشف مؤلكل أن يتفاعل مع مجموعات ثيول المجانية مثل موجودة في cysteines، في الرقم الهيدروجيني من 6،5-7،5، لتشكيل مستقر ثيو استر(الشكل 1). في ارتفاع درجة الحموضة، ويمكن NEM أيضا تتفاعل مع مجموعات الأمينية أو الخضوع التحلل 15. وعادة ما تستخدم NEM لمنع الجماعات ثيول الحرة، وذلك لمنع تشكيل ثاني كبريتيد السندات أو تمنع النشاط الأنزيمي. على سبيل المثال، غالبا ما يستخدم NEM لمنع desumoylating الإنزيمات، والتي هي البروتياز السيستين. في بروتوكول التعاون مناعي وصفها، أدرج NEM في البداية في المخزن المؤقت تحلل لقد ذكر أن sumoylation من البروتينات الإنفلونزا يمكن أن تؤثر في التفاعل بين البروتينات الفيروسية 16. بشكل غير متوقع، أثبتت إضافة NEM أن يكون المفتاح لتوثيق التفاعل بين NP الإنفلونزا، والماوس MX1 التي شارك في مناعي. ومن غير الواضح لماذا إضافة NEM أمر حاسم للكشف عن التفاعل NP-MX1. ربما التفاعل هو عابر جدا و / أو ضعيف. NEM يمكن تحقيق الاستقرار في التفاعل، على سبيل المثال، من خلال الحفاظ على التشكل محدد من MX1، وهو بروتين فيروسي أو حتى كومبو الثالث غير معروفnent. وقد لوحظ مثل هذا أثر في تحقيق الاستقرار من NEM من قبل، على سبيل المثال، للتفاعل بين اختزال الريبونوكليوتيد M1 وجيمسيتابين المانع لها (F2dC) 17. MX1 وNP كلا تحتوي على بقايا السيستين متعددة والتي يمكن تعديلها من قبل NEM. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أجرتها ريني آخرون أن stalkless MXA-البديل يحتوي على ثلاثة المذيبات بقايا السيستين يتعرض التي يمكن تعديلها من قبل iodoacetamide. تحور هذه المخلفات إلى serines لم يؤثر على النشاط الأنزيمي من MXA، ولكن منعت بوساطة ثاني كبريتيد التجميع 18. كما يتم حفظها هذه cysteines في MX1، وهذا يشير إلى أن cysteines مماثل في MX1 يمكن تعديلها من قبل NEM وعلى هذا النحو تأثير التشكل، أو الذوبان. وبالإضافة إلى ذلك، NEM قد تؤثر أيضا على النشاط GTPase من MX1، وهو أمر ضروري للنشاط مضاد للأنفلونزا من MX1، وبالتالي تحقيق الاستقرار في التفاعل بين MX1 وNP. ومع ذلك، فإن التأثير المباشر للNEM على تشغيل إشارات GTPasevity من MX1 غير المحتمل، كما هو مطلوب NEM أيضا للكشف عن التفاعل بين NP الإنفلونزا، وGTPase المسوخ غير نشطة من البروتين MX1 14. ومن الواضح أن هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لكشف تأثير NEM على التفاعل NP-MX1.
وباختصار، فإن بروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح لدراسة التفاعل بين البروتين MX1 المضادة للفيروسات وهدفه الفيروسي والأنفلونزا البروتين NP. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة أخرى التفاعلات الضعيفة أو عابرة التي تعتمد على استقرار التشكل البروتين محددة. وقد وصفت البروتين البروتين التفاعل التي تعتمد على التشكل محددة من قبل، على سبيل المثال، على البروتينات ملزم الكالسيوم مثل كالمودولين 19. وأخيرا، يمكن أن تستخدم أيضا دور الفعال لNEM في الطرق الأخرى التي تكشف عن تفاعلات البروتين البروتين، مثل فحوصات المشارك الترسيب.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسة التفاعل بين البروتينات المضادة للفيروسات وأهدافها الفيروسية مهم جدا لفهم تفاصيل آلية المضادة للفيروسات من هذه البروتينات. هذا يمكن أن تعطي رؤى جديدة في كيفية الفيروسات ومضيفيهم شارك تطورت وتكون أساسا لوضع استراتيجيات المضادة للفيروسات جديدة. والأمثل بروتوك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل FWO-فلاندر، ومشروع الاحتلال IOF10 / StarTT / 027 وجامعة غنت الخاصة بحوث غرانت BOF12 / GOA / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
References
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
- Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
- Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
- Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
- Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
- Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
- Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
- Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
- Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
- Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
- Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).
- Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
- Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
- Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
- Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
- Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).
