이 공동 면역침전 프로토콜을 통해 인간 세포에서 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질과 항바이러스 Mx1 단백질 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Mx1 및 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질의 성공적인 동시 면역침전을 위한 N-에틸말레이미드의 중요성을 강조합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 간의 상호 작용을 연구하는 것은 단백질의 기능을 이해하는 데 중요합니다. 복잡한 샘플에서 단백질과 다른 거대분자의 상호 작용을 연구하는 데 자주 사용되는 매우 강력한 방법은 공동 면역침전(co-immunoprecipitation)이라고 합니다. 설명된 동시 면역침전 프로토콜을 통해 항바이러스 점액바이러스 내성 단백질 1(Mx1)과 바이러스 표적 중 하나인 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질(NP) 간의 상호 작용을 입증하고 추가로 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 형질주입된 포유류 세포로 시작하지만, 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 세포를 시작 물질로 사용하는 것도 가능합니다. 세포 용해 후, 바이러스 NP 단백질은 특정 항체로 끌어당겨지고 생성된 면역 복합체는 단백질 G 비드로 침전됩니다. NP의 성공적인 풀다운과 항바이러스 Mx1 단백질의 동시 면역침전은 이후 웨스턴 블로팅에 의해 밝혀졌습니다. Mx1과 NP의 성공적인 동시 면역침전을 위한 전제 조건은 세포 용해 완충액에 N-에틸말레이미드(NEM)가 존재해야 한다는 것입니다. NEM은 유리 티올 그룹을 알킬레이트합니다. 아마도 이 반응은 Mx1의 특정 형태, 바이러스 표적 또는 알려지지 않은 제3의 성분을 보존함으로써 약한 및/또는 일시적인 NP-Mx1 상호 작용을 안정화합니다. 공동 면역침전 실험의 중요한 한계는 단백질이 단백질 G bead 또는 항체에 비특이적으로 결합함으로써 발생하는 오염 단백질의 부주의한 풀다운입니다. 따라서 가양성 결과를 제외하는 제어 설정을 포함하는 것이 매우 중요합니다. 설명된 공동 면역침전 프로토콜은 다른 척추동물 종의 Mx 단백질과 바이러스 단백질, 모든 쌍의 단백질 또는 단백질과 다른 거대분자의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 약한 상호 작용 및/또는 일시적인 상호 작용을 안정화하기 위한 NEM의 유익한 역할은 각 상호 작용 쌍에 대해 개별적으로 테스트해야 합니다.
서론
믹소 바이러스 저항 (MX) 단백질은 바이러스 성 병원체에 대한 선천성 면역 방어의 중요한 부분입니다. 이 단백질은 유형 I 및 유형 III 인터페론에 의해 유도되는 큰 dynamin 같은 GTP 아제 있습니다. 대응 MX 유전자는 하나 또는 여러 복사본 거의 모든 척추 동물에 존재하고 이들 유전자 산물은 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae) (예., 인플루엔자 바이러스), Rhabdoviridae (예., 수 포성 구내염 바이러스), Bunyaviridae (예를 포함한 광범위한 바이러스를 억제한다. , 라크로스 바이러스)와 (예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스 1) 1-4 Retroviridae. 이 단백질은 바이러스와 같은 광범위한 인식 방법 명백한 공유 기본 순서가이 바이러스에 모티브없이 그것은 불분명하다. 잠재적으로 그들의 타겟을 갖는 MX 바이러스 단백질의 상호 작용을 분석하는 다른 숙주 세포 인자 고차 복합체를 포함하는, t 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 것모자는 바이러스 및 호스트 사이의 군비 경쟁에 진화했다.
MX 포유류 단백질과 바이러스 표적 사이의 상호 작용은 인간 MXA 위해 가장 광범위....
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프로토콜
참고 : 다음 형질과 공동 면역 프로토콜 9cm 페트리 접시의 형식이 설정됩니다. 다른 포맷은 프로토콜들을 스케일링 한 후도 가능하다.
1. 시드 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포
- 10 % 소 태아 혈청 및 2 mM L- 글루타민, 0.4 mM의 나트륨 피루 베이트로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 12 ㎖ 중의 9cm 페트리 접시 당 1.2 × 106 세포에 형질 감염 전에 HEK293T 세포 하루 시드 0.1 mM 비 필수 아미노산, 100 U / ml의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신.
- 세포를 37 ℃에서 16 시간, 5 % CO 2를 성장.
- 시각적으로 형질 전환 전에 거꾸로 광학 현미경으로 형태 및 세포의 생존 능력을 검사합니다. 세포는 최적의 효율을위한 형질 서브 컨 플루 언트가 될 필요가있다.
HEK293T 세포 2. 칼슘 - 포스페이트 형질
주의: 사용 0.5 pCAXL-NP 또는 9cm 접시 당 pCAXL-MX1의 1-3 μg의와 함께 빈 pCAXL 플라스미드의 μg의. 모든 시료에서 총 ....
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결과
N - 에틸 말레이 비가 역적 시스테인 프로테아제 (도 1)를 억제하는 예를 자유 티올기를 수정할 수있다 유기 화합물이다.
바이러스 MX1 단백질은 인플루엔자에게 바이러스의 핵 단백질과 상호 작용하여 바이러스 복제를 억제한다. 여기에 설명 된 최적화 된 공동 면역 프로토콜이 NP-MX1의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. HEK293T 세포는 인플루엔자 NP 단백질의 부재 또는 존재하에 MX1 바이러스 단백질 발현 벡터로 형질 감염시켰다. 다음으로, NP 단백질은 NP 특이 모노클로 날 항체로 총 세포 용 해물로부터 인출 다운이었다. 2 MX1 단백질 만 공동 면역 침전 공동 발현 NP의 존재 있음을 보여준다. NP의 부재 MX1 가능 비특이적 공동 면역 침전은 항 NP 항체에 의해 또는 MX1의 비특이적 결합함으로써 MX1 단백질의 비특이적 풀다운 두 경우에 발생단백.......
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토론
바이러스 단백질 및 바이러스 표적 사이의 상호 작용을 연구하는 이들 단백질의 항 바이러스기구의 상세를 이해하는 것이 매우 중요하다. 이 새로운 항 바이러스 전략의 개발을위한 기초를 바이러스 및 그들의 호스트가 진화 공동 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 최적화 공동 면역 침전 프로토콜 마우스 MX1 단백질 및 그 대상 바이러스, 인플루엔자 NP 단백질 사이의 상호 작용을 연구 할 수있다. NP-MX1 상호 작용 NEM (도 3)이 부재 인 탐지이 프로토콜의 가장 중요한 측면은, 용해 완충액에서 NEM의 추가이다. 현재까지이를 NEM의 존재가이 상호 작용을 검출하기 위해 필수적이다 이유 알려져 있지 않다. 그러나,이 프로토콜은 시스테인이 참여하고 특히, 특정 단백질의 입체의 안정화에 따라 다른 약 및 / 또는 과도 상호 작용을 연구하는 것이 유용 할 수 있습니다.
일반적으로 공동 - 면역 침전 분석법의 중요한 한계는.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 FWO - 데런, IOF 프로젝트 IOF10 / StarTT / 027 및 겐트 대학교 특별 연구비 BOF12 / GOA / 014에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM 고포도당 | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | 독성 |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | NP40 |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | 11 873 580 001 | |
| 항-NP 단클론 항체 | NIH 생물방어 및 신종 감염 연구 리소스 저장소 | NR-4282 | 복수 클론 A1 및 A3 |
| 항 RNP 다클론 혈청 | NIH 생물 방어 및 신흥 감염 연구 자원 저장소 | NR-3133 | A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL 웨스턴 블로팅 기판 | Pierce | 32106 |
참고문헌
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature.....
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재인쇄 및 허가
