Co-immunoprecipitation av musen Mx1 Protein med influensa A virus nucleoprotein
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
Myxoviruset motstand (Mx) proteiner er en viktig del av det medfødte immunforsvaret mot virus patogener. Disse proteinene er store dynamin lignende GTPases som er indusert av type I og type III-interferoner. De tilsvarende Mx-gener er til stede i nesten alle virveldyr i ett eller flere kopier og deres genprodukter inhibere et bredt spekter av virus, inkludert Orthomyxoviridae (f.eks., Influensavirus), Rhabdoviridae (f.eks., Vesikulært stomatitt-virus), Bunyaviridae (f.eks. , la crosse virus) og Retroviridae (f.eks humant immunsviktvirus-1) 1-4. Det er uklart hvordan disse proteinene gjenkjenne et så bredt spekter av virus, uten noen åpenbar delt primær sekvens motivene i disse virusene. Analysere samspillet av Mx proteiner med sine viral mål, potensielt involverer høyere ordens komplekser med andre vertscelle faktorer, vil bidra til å forstå de molekylære mekanismene tlue har utviklet seg i våpenkappløpet mellom virus og deres verter.
Samspillet mellom pattedyr Mx-proteiner og virale mål har blitt studert i utstrakt grad for human MXa. Humant MXa kan hemme replikasjon av flere virus, herunder ortomyksovirus influensa A og Thogoto virus. MXa binder Thogoto virus ribonukleoproteinpartikler komplekser (vRNPs), for derved å hindre deres atom inn, noe som resulterer i blokk av infeksjon 5. Dette samspillet mellom MXA og Thogoto virus vRNPs har blitt demonstrert med co-sedimente og co-immunoutfellingsstudier eksperimenter 6-9. Hvordan Mx proteiner hindre influensa A-virus er mindre klar. Et stort problem er at det er ikke enkelt å påvise en interaksjon mellom en Mx-protein og et influensa-genproduktet. En rapport viste et samspill mellom menneske MXA og NP protein i influensa A virus infiserte celler 10. Dette samspillet kan bare vises ved co-immunoprecipitation hvis cellene var blitt behandlet med det tverrbindende reagens-ditiobis (succinimidyl propionat) før lysering, noe som antyder at interaksjonen er forbigående og / eller svak. Nyere studier har vist at den differensielle Mx følsomheten av forskjellige influensa A-stammer bestemmes av opprinnelsen av NP-proteinet 11,12. I tråd med dette, kan influensa A-virus delvis flykte fra Mx kontroll ved å mutere spesifikke rester i NP protein 13. Dette tyder på at hovedmålet for influensa A-virus for verts Mx er NP protein, mest sannsynlig NP montert i vRNP komplekser. Men ingen av disse nyere studiene viste en interaksjon mellom influensa NP eller vRNPs og enten menneskelig MXA eller mus Mx1.
Nylig viste, for første gang, en interaksjon mellom influensa NP og musen Mx1 protein med en optimalisert co-immunoutfelling protokoll 14 som er beskrevet her i detalj. Generelt, co-immunoprecipitation er en av de mest brukte biokjemiske metoder for å undersøke protein-protein interaksjoner. Denne teknikk blir ofte foretrukket fremfor alternative teknikker, for eksempel, gjær to-hybrid, siden det gjør det mulig å undersøke protein-protein interaksjoner i sitt naturlige miljø. Co-immunoutfelling kan utføres på endogent uttrykte proteiner dersom antistoffer mot proteiner av interesse er tilgjengelig. Alternativt kan proteinene av interesse bli uttrykt i cellen gjennom transfeksjon eller infeksjon, og en affinitetsmerkelapp kan anvendes. I tillegg til de ovennevnte fordeler, tillater den beskrevne ko-immunoutfelling protokoll detektering av svake og / eller forbigående protein interaksjoner. Hovedkomponenten i dette optimalisert protokollen er tilsetning av N-etylmaleimid (NEM) i cellelyseringsbuffer. NEM er et alkylerende reagens som reagerer med frie tiol-grupper som er til stede i cysteiner, ved en pH på 6,5 til 7,5, for å danne en stabil tio-esteren(Figur 1). Ved høyere pH-verdi, kan NEM også reagere med aminogrupper eller gjennomgå hydrolyse 15. NEM blir typisk brukt for å blokkere frie tiolgrupper, for å hindre dannelse av disulfidbinding eller inhibere enzymatisk aktivitet. For eksempel er NEM ofte brukt til å blokkere desumoylating enzymer, som er cysteinproteaser. I den beskrevne ko-immunoutfelling protokollen, ble NEM innledningsvis inkludert i lyseringsbuffer, fordi det var blitt rapportert at sumoylation av influensa proteiner kan påvirke interaksjonen mellom virale proteiner 16. Uventet, tillegg av NEM viste seg å være nøkkelen til å dokumentere samspillet mellom influensa NP og mus Mx1 av co-immunoprecipitation. Det er uklart hvorfor tilsetningen av NEM er avgjørende for å detektere NP-Mx1 interaksjon. Muligens samspillet er for forbigående og / eller svak. NEM kunne stabilisere samhandling, for eksempel, ved å bevare en bestemt konformasjon av Mx1, en viral protein eller til og med en ukjent tredje component. En slik stabiliserende effekt av NEM har blitt observert før, for eksempel, for samspillet mellom ribonukleotidreduktase M1 og dens inhibitor gemcitabin (F2dC) 17. MX1 og NP begge inneholder flere cysteinrester som kan være modifisert med NEM. For eksempel, en fersk undersøkelse utført av Rennie et al. Viste at en stalkless MXA-varianten inneholder tre løsemiddel utsatt cysteinresiduer som kan modifiseres av iodoacetamide. Mutere disse rester til seriner ikke påvirke den enzymatiske aktiviteten til MXa, men forhindret disulfid-mediert aggregering 18. Ettersom disse cysteiner er bevart i Mx1, tyder dette på at de analoge cysteiner i Mx1 kan endres av NEM og som sådan innflytelse sin konformasjon eller oppløselighet. I tillegg kan NEM også påvirke GTPase aktivitet av Mx1, noe som er viktig for anti-influensaaktivitet av Mx1, og derved stabilisere interaksjonen mellom Mx1 og NP. Men en direkte effekt av NEM på GTPase aktiteten av Mx1 er usannsynlig, som NEM er også nødvendig for å påvise samspillet mellom influensa NP og GTPase inaktive mutanter av den Mx1 protein 14. Åpenbart trengs mer forskning for å avdekke effekten av NEM på NP-Mx1 interaksjon.
Oppsummert kan den beskrevne ko-immunoutfelling protokollen for å studere interaksjonen mellom den antivirale Mx1 protein og dets virale mål, influensa NP-protein. Denne protokollen kan også brukes til å studere andre svake eller flyktige interaksjoner som avhenger av stabilisering av spesifikke protein-konformasjoner. Protein-protein interaksjon som er avhengig av bestemte konformasjoner er blitt beskrevet tidligere, f.eks for kalsiumbindende proteiner så som kalmodulin 19. Endelig kunne det gunstig rolle for NEM også brukes i andre fremgangsmåter som gjenkjenner protein-protein interaksjoner, for eksempel ko-sedimenteringsanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Å studere interaksjonen mellom antivirale proteiner og deres virale mål er svært viktig å forstå detaljene i den antivirale mekanismen for disse proteinene. Dette kan gi ny innsikt i hvordan virus og deres verter co-utviklet seg og være grunnlag for utvikling av nye antivirale strategier. Den optimaliserte co-immunoprecipitation protokollen beskrevet her gjør det mulig å studere samspillet mellom mus Mx1 protein og dens viral målet, influensa NP protein. Det viktigste aspekt ved denne protokollen er tilsetninge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av FWO-Vlaanderen, IOF prosjektet IOF10 / STARTt / 027 og Ghent universitet Spesialstipend BOF12 / GOA / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
References
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
- Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
- Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
- Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
- Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
- Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
- Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
- Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
- Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
- Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
- Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).
- Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
- Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
- Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
- Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
- Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).
