Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Summary

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Abstract

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

Introduction

Resistência myxovirus (Mx) proteínas são uma parte importante da defesa imune inata contra patógenos virais. Estas proteínas são grandes GTPases dinamina-like que são induzidos por tipo I e tipo III interferons. Os genes Mx correspondentes estão presentes em quase todos os vertebrados em uma ou várias cópias e dos seus produtos de genes inibir uma vasta variedade de vírus, incluindo Orthomyxoviridae (por exemplo., O vírus da gripe), Rhabdoviridae (por exemplo., O vírus da estomatite vesicular), Bunyaviridae (por exemplo. , La Crosse vírus) e Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana-1) ^1-4. Não está claro como estas proteínas reconhecer uma ampla gama de vírus tais, sem qualquer sequência primária compartilhada aparente motivos na estes vírus. Analisando a interação de proteínas Mx com seus alvos virais, potencialmente envolvendo complexos de ordem superior com outros fatores de célula hospedeira, irá ajudar a compreender os mecanismos moleculares tchapéu evoluíram na corrida armamentista entre os vírus e seus hospedeiros.

A interação entre as proteínas de mamíferos e Mx alvos virais tem sido estudado mais extensivamente para MxA humano. MxA humano pode inibir a replicação de muitos vírus, incluindo o vírus influenza A orthomyxovirus e vírus Thogoto. MxA liga os complexos de ribonucleoproteína vírus Thogoto (vRNPs), impedindo assim a sua entrada nuclear, o que resulta no bloqueio da infecção ^5. Esta interacção entre MXA e Thogoto vRNPs vírus tem sido demonstrado com a co-sedimentação e de co-imunoprecipitação experiências ^6-9. Como proteínas Mx dificultar vírus da gripe A é menos clara. Um problema principal é que não é fácil de demonstrar uma interacção entre uma proteína Mx e um produto de gene da influenza. Um relatório demonstrou uma interação entre MxA humana e da proteína NP em influenza A células infectadas pelo vírus ^10. Essa interação só poderia ser demonstrado por co-immunoprecipitation se as células terem sido tratadas com as de reticulação reagentes ditiobis (propionato de succinimidilo), antes de lise, sugerindo que a interacção é transitória e / ou fraco. Estudos mais recentes têm mostrado que a sensibilidade diferencial Mx de estirpes diferentes de influenza A é determinado pela origem da proteína NP ^11,12. Em linha com esta, os vírus da gripe A pode escapar do controle, em parte, Mx por mutação resíduos específicos na proteína NP ^13. Isto sugere que o principal alvo dos vírus influenza para acolhimento Mx é a proteína NP, provavelmente NP montados em complexos vRNP. No entanto, nenhum desses estudos mais recentes demonstraram uma interacção entre a gripe NP ou vRNP e MxA quer humano ou de ratinho Mx1.

Recentemente, demonstrou, pela primeira vez, uma interacção entre o NP de influenza e da proteína Mx1 rato com um protocolo de co-imunoprecipitação optimizado ^14, a qual é descrita aqui em detalhe. Em geral, a co-immunoprecipitation é uma das abordagens bioquímicas mais freqüentemente utilizados para investigar as interações proteína-proteína. Esta técnica é muitas vezes preferido ao longo técnicas alternativas, por exemplo, de leveduras duplamente híbrido, uma vez que permite investigar interacções proteína-proteína no seu ambiente natural. Co-imunoprecipitação pode ser levada a cabo em proteínas expressas endogenamente, se os anticorpos contra as proteínas de interesse estão disponíveis. Alternativamente, as proteínas de interesse podem ser expressos na célula através de transfecção ou infecção e um tag de afinidade pode ser usado. Além das vantagens acima mencionadas, o protocolo de co-imunoprecipitação descrita permite a detecção de interacções proteína fracos e / ou transientes. O principal componente neste protocolo optimizado é a adição de N-etilmaleimida (NEM) em tampão de lise celular. NEM é um reagente de alquilação, que reage com grupos tiol livres tais como presentes em cisteínas, a um pH de 6,5-7,5, para formar uma tio-éster estável(Figura 1). A pH mais elevado, a NEM também pode reagir com grupos amino ou sofrer hidrólise ^15. NEM é normalmente utilizado para bloquear os grupos tiol livres, a fim de evitar a formação de ligações dissulfureto ou inibir a actividade enzimática. Por exemplo, a NEM é muitas vezes usado para bloquear enzimas desumoylating, que são proteases de cisteína. No protocolo de co-imunoprecipitação descrita, NEM foi inicialmente incluído no tampão de lise, porque tinha sido relatado que o sumoilação de proteínas de influenza podem influenciar a interacção entre as proteínas virais ^16. Inesperadamente, a adição de NEM provou ser a chave para documentar a interacção entre NP de influenza e rato Mx1 por co-imunoprecipitação. Não está claro porque a adição de NEM é crucial para detectar a interacção NP-Mx1. Possivelmente, a interacção é muito transiente e / ou fraco. NEM poderia estabilizar a interacção, por exemplo, ao preservar uma conformação específica de Mx1, uma proteína viral, ou ainda um terceiro compo desconhecidonente. Tal efeito estabilizante de NEM foi observada antes, por exemplo, para a interacção entre a ribonucleótido-redutase M1 e o seu inibidor gemcitabina (F2dC) ^17. Mx1 e NP ambos contêm múltiplos resíduos de cisteína que poderiam ser modificados por NEM. Por exemplo, um estudo recente da Rennie et al. Demonstraram que uma stalkless MxA variante contém três resíduos de cisteína expostos solventes que podem ser modificados por iodoacetamide. Mutação destes resíduos para serines não influenciou a atividade enzimática da MxA, mas impediu a agregação mediada por dissulfeto ^18. À medida que estas cisteínas são conservadas em Mx1, isto sugere que os análogos em cisteínas Mx1 pode ser modificada por NEM e, como tal influência sua conformação ou solubilidade. Além disso, a NEM também pode afectar a actividade de GTPase de Mx1, que é essencial para a actividade anti-gripe de Mx1, e assim estabilizar a interacção entre Mx1 e NP. No entanto, um efeito directo de NEM na GTPase actividade de Mx1 é improvável, como NEM também é necessária para detectar a interação entre a gripe NP e GTPase mutantes inativos da proteína Mx1 ^14. Claramente, é necessária mais investigação para desvendar o efeito de NEM na interação NP-Mx1.

Em resumo, o protocolo de co-imunoprecipitação descrita permite estudar a interacção entre a proteína antiviral Mx1 e seu alvo viral, a proteína NP da gripe. Este protocolo poderia também ser utilizada para estudar outras interacções fracas ou transientes que dependem da estabilização de conformações de proteínas específicas. Interacção proteína-proteína que dependem conformações específicos têm sido descritos antes, por exemplo, para as proteínas de ligação ao cálcio, tais como a calmodulina ^19. Finalmente, o papel benéfico de NEM também pode ser usado noutros métodos que detectam interacções proteína-proteína, tais como ensaios de co-sedimentação.

Protocol

Nota: O seguinte protocolo de transfecção e co-imunoprecipitação é estabelecida para um formato de placa de Petri 9 cm. Outros formatos também são possíveis após a escala do protocolo. 1. Sementeira do rim embrionário humano (HEK) Células 293T Semente da células HEK293T um dia antes da transfecção a 1,2 x 10 6 culas por 9 centímetros de Petri em 12 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-g…

Representative Results

N-etilmaleimida é um composto orgânico que pode ser utilizado para modificar irreversivelmente grupos tiol livres, por exemplo, para inibir as proteases de cisteína (Figura 1). A proteína antiviral Mx1 inibe a replicação do vírus da gripe A, interagindo com a nucleoproteína virai. O protocolo de co-imunoprecipitação otimizado aqui descrito permite estudar essa interação NP-Mx1. Células HEK293T foram transfectadas com vectores de expressão para a prote?…

Discussion

O estudo da interacção entre proteínas antivirais e seus alvos virais é muito importante para compreender os detalhes do mecanismo antiviral destas proteínas. Isso pode dar novos insights sobre como os vírus e seus hospedeiros co-evoluído e ser a base para o desenvolvimento de novas estratégias antivirais. O protocolo de co-imunoprecipitação optimizado descrito aqui permite o estudo da interacção entre a proteína de rato e a sua Mx1 alvo viral, a proteína NP da gripe. O aspecto mais importante deste protoc…

Materials

DMEM high glucose	Gibco	52100-047
N-Ethylmaleimide	Sigma	E-3876	Toxic
Igepal CA-630	Sigma	I-30212	also known as NP40
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11 873 580 001
anti-NP monoclonal antibody	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-4282	ascites blend of clones A1 and A3
anti-RNP polyclonal serum	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-3133	directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)
Protein G Sepharose 4FF	GE Healthcare	17-0618-01
Hyperfilm ECL 18 x 24 cm	GE Healthcare	28-9068-36
ECL Western Blotting Substrate	Pierce	32106