Co-immunoprecipitation av Mouse Mx1 Protein med influensa A-virus nukleoprotein
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
Myxovirus motstånd (Mx) proteiner är en viktig del av det medfödda immunförsvaret mot virala patogener. Dessa proteiner är stora dynamin liknande GTPaser som induceras av typ I och typ III-interferoner. Motsvarande Mx gener är närvarande i nästan alla ryggradsdjur i en eller flera kopior och deras genprodukter inhiberar ett brett spektrum av virus, inklusive Orthomyxoviridae (t.ex.., Influensavirus), Rhabdoviridae (t ex., Vesikulärt stomatitvirus), Bunyaviridae (t.ex.. , LaCrosse virus) och Retroviridae (t.ex. humant immunbristvirus-1) 1-4. Det är oklart hur dessa proteiner erkänna ett sådant brett spektrum av virus, utan någon uppenbar delad primär sekvensmotiv i dessa virus. Analysera samspelet i Mx-proteiner med sina virus mål, potentiellt involverar högre ordningens komplex med andra värdcellsfaktorer, kommer att bidra till att förstå de molekylära mekanismerna thatt har utvecklats i kapprustningen mellan virus och deras värdar.
Samspelet mellan däggdjur Mx proteiner och virala mål har studerats mest omfattande för mänsklig MxA. Human MxA kan hämma replikation av många virus, inklusive ortomyxovirus influensa A och Thogoto virus. MxA binder Thogoto virus ribonukleoprotein komplex (vRNPs), på så sätt förhindra deras kärnvapen posten, vilket resulterar i blocket för infektion 5. Denna interaktion mellan MXA och Thogoto virus vRNPs har visats med co-sedimente och co-Immunutfällningsexperiment 6-9. Hur Mx proteiner hindrar influensa A-virus är mindre tydlig. Ett stort problem är att det inte är enkelt att visa en interaktion mellan en Mx-protein och en gen influensaprodukt. En rapport visade en interaktion mellan människa MxA och NP proteinet i influensa A-virus infekterade celler 10. Denna interaktion kan endast visas med co-immunoprecipitation om cellerna hade behandlats med tvärbindningsreagenset ditiobis (succinimidylpropionat) innan lys, vilket tyder på att interaktionen är övergående och / eller svag. Nyare studier har visat att skillnaden Mx känslighet olika influensa A-stammar bestäms av ursprunget till NP-proteinet 11,12. I linje med detta, kan influensa A-virus delvis fly från Mx-kontroll genom att mutera specifika rester i NP-proteinet 13. Detta tyder på att det främsta målet för influensa A-virus för värd Mx är NP-proteinet, troligen NP monteras i vRNP komplex. Men ingen av dessa nyare studier visat en interaktion mellan influensa NP eller vRNPs och antingen human MxA eller mus Mx1.
Nyligen visade vi, för första gången, en interaktion mellan influensa NP och musen Mx1 proteinet med en optimerad sam-immunoutfällning protokoll 14, vilket beskrivs i detalj här. I allmänhet, co-immunoprecipitation är en av de mest använda biokemiska metoder för att undersöka protein-proteininteraktioner. Denna teknik är ofta föredraget jämfört med alternativa tekniker, t.ex., jäst två-hybrid, eftersom det gör det möjligt att undersöka protein-protein-interaktioner i deras naturliga miljö. Co-immunoutfällning kan utföras på endogent uttryckta proteiner om antikroppar mot proteinerna av intresse föreligger. Alternativt kan proteinerna av intresse uttryckas i cellen genom transfektion eller infektion och en affinitetsmarkör kan användas. Förutom de ovan nämnda fördelarna, gör den beskrivna sam-immunoutfällning protokoll detektion av svaga och / eller transienta proteininteraktioner. Huvudkomponenten i denna optimerade protokoll är tillsatsen av N-etylmaleimid (NEM) i cellen lysbuffert. NEM är ett alkyleringsreagens som reagerar med fria tiolgrupper såsom närvarande i cysteiner, vid ett pH av 6,5 till 7,5, för att bilda en stabil tio-estern(Figur 1). Vid högre pH, kan NEM också reagera med aminogrupper eller genomgå hydrolys 15. NEM används typiskt för att blockera fria tiolgrupper, i syfte att förhindra bildning av disulfidbindning eller inhiberar enzymatisk aktivitet. Till exempel är NEM ofta används för att blockera desumoylating enzymer, vilka är cysteinproteaser. I den beskrivna co-immunoutfällning protokoll, blev NEM initialt ingår i lysbufferten eftersom det hade rapporterats att sumoylation av influensaproteiner kan påverka interaktionen mellan virala proteiner 16. Oväntat, tillägg av NEM visade sig vara nyckeln till att dokumentera samspelet mellan influensa NP och mus Mx1 genom co-immunoprecipitation. Det är oklart varför tillsatsen av NEM är avgörande för att detektera NP-Mx1 interaktion. Möjligen interaktionen är för övergående och / eller svag. NEM kunde stabilisera interaktion, t.ex. genom att bevara en viss konforma Mx1, ett virusprotein eller ens en okänd tredje komponent. En sådan stabiliserande effekt NEM har observerats tidigare, till exempel, för interaktionen mellan ribonukleotidreduktas M1 och dess hämmare gemcitabin (F2dC) 17. MX1 och NP båda innehåller flera cysteinrester som kan modifieras av NEM. Till exempel, en färsk undersökning från Rennie et al. Visade att en stalkless MxA-varianten innehåller tre lösningsmedels exponerade cysteinrester som kan modifieras genom jodoacetamid. Mutera dessa rester till seriner påverkade inte den enzymatiska aktiviteten hos MxA, men förhindrade disulfid-medierad aggregering 18. Eftersom dessa cysteiner bevaras i Mx1, tyder detta på att de analoga cysteiner i Mx1 kan modifieras genom NEM och som sådan påverkan dess konforma eller löslighet. Dessutom kan NEM också påverka GTPas aktivitet Mx1, vilket är väsentligt för aktiviteten hos Mx1 anti-influensa, och därigenom stabilisera interaktionen mellan Mx1 och NP. Men en direkt effekt av NEM på GTPas ACTIvitet i Mx1 är osannolikt, eftersom NEM krävs också för att detektera interaktionen mellan influensa NP och GTPase inaktiva mutanter av Mx1 proteinet 14. Klart, det behövs mer forskning för att reda ut effekten av NEM på NP-Mx1 interaktion.
Sammanfattningsvis medger det beskrivna sam-immunoutfällning protokoll för att studera interaktionen mellan den antivirala Mx1 proteinet och dess virala mål, influensa NP-proteinet. Detta protokoll kan också användas för att studera andra svaga eller transienta interaktioner som beror på stabilisering av specifika proteinkonformationer. Protein-protein-interaktion som är beroende av specifika konformationer har beskrivits tidigare, t ex för kalciumbindande proteiner såsom kalmodulin 19. Slutligen kan den gynnsamma roll NEM även användas i andra metoder som detekterar protein-proteininteraktioner, såsom sam-sedimente analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studera interaktionen mellan antivirala proteiner och deras virala mål är mycket viktigt att förstå detaljerna i den antivirala mekanismen av dessa proteiner. Detta kan ge nya insikter i hur virus och deras värdar samar utvecklats och ligga till grund för utvecklingen av nya antivirala strategier. Den optimerade sam-immunoutfällning Protokollet som beskrivs här gör det möjligt att studera interaktionen mellan musen Mx1 proteinet och dess virala mål, influensa NP-proteinet. Den viktigaste aspekten av detta pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av FWO-Vlaanderen, IOF-projektet IOF10 / StarTT / 027 och Gents universitet Special Research Grant BOF12 / GOA / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
References
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
- Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
- Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
- Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
- Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
- Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
- Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
- Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
- Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
- Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
- Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).
- Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
- Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
- Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
- Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
- Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).
