Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
Resistenza Myxovirus (Mx) proteine sono una parte importante della difesa immunitaria innata contro i patogeni virali. Queste proteine sono grandi GTPases Dynamin simili che sono indotti da tipo I e tipo III interferoni. I corrispondenti geni Mx sono presenti in quasi tutti i vertebrati in una o più copie e loro prodotti genici inibiscono un'ampia gamma di virus, compresi Orthomyxoviridae (ad es., Virus dell'influenza), Rhabdoviridae (ad es., Virus della stomatite vescicolare), Bunyaviridae (es. , virus crosse la) e Retroviridae (ad esempio, il virus dell'immunodeficienza umana-1) 1-4. Non è chiaro come queste proteine riconoscono una così ampia gamma di virus, senza alcuna sequenza primaria apparente condiviso motivi in questi virus. Analizzando l'interazione delle proteine Mx con i loro obiettivi virali, potenzialmente coinvolge complessi di ordine superiore con altri fattori della cellula ospite, aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari tCappello si sono evoluti nella corsa agli armamenti tra virus e loro ospiti.
L'interazione tra le proteine di mammiferi Mx e target virali è stato studiato più ampiamente per MxA umana. MxA umana può inibire la replicazione di molti virus, tra cui il ortomixovirus influenza A e virus Thogoto. MxA lega complessi ribonucleoproteici virus Thogoto (vRNPs), impedendo così il loro ingresso nucleare, che si traduce nel blocco di infezione 5. Questa interazione tra MxA e Thogoto vRNPs virus è stata dimostrata con il co-sedimentazione e co-immunoprecipitazione esperimenti 6-9. Come proteine Mx ostacolano virus dell'influenza A è meno chiaro. Uno dei problemi principali è che non è semplice dimostrare una interazione tra una proteina Mx e un prodotto genico influenza. Un rapporto ha dimostrato un'interazione tra MxA umana e la proteina NP in influenza A virus cellule infettate 10. Questa interazione può essere visualizzato solo dal co-immunoprecipitation se le cellule erano stati trattati con le ditiobis reticolanti reagenti (succinimidil propionato) prima lisi, suggerendo che l'interazione è transitorio e / o debole. Studi più recenti hanno dimostrato che la sensibilità Mx differenziale di diversi ceppi di influenza A è determinata dall'origine della proteina NP 11,12. In linea con questo, i virus influenzali A possono sfuggire in parte dal controllo Mx mutando residui specifici nella proteina NP 13. Questo suggerisce che l'obiettivo principale del virus dell'influenza per host MX è la proteina NP, probabilmente NP assemblato in complessi vRNP. Tuttavia, nessuno di questi studi più recenti hanno dimostrato una interazione tra influenza NP o vRNPs e sia umana MxA o il mouse MX1.
Recentemente abbiamo mostrato, per la prima volta, una interazione tra l'influenza NP e la proteina Mx1 mouse con un protocollo ottimizzato co-immunoprecipitazione 14, che è qui descritto in dettaglio. In generale, i co-mmunoprecipitation è uno degli approcci biochimici più frequentemente utilizzati per indagare le interazioni proteina-proteina. Questa tecnica è spesso preferito su tecniche alternative, ad esempio, due ibridi di lievito, in quanto consente di studiare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale. Co-immunoprecipitazione può essere eseguita su proteine espresse endogenamente se sono disponibili anticorpi contro le proteine di interesse. In alternativa, le proteine di interesse possono essere espressi nella cellula attraverso trasfezione o infezione e un tag di affinità possono essere utilizzati. Oltre ai vantaggi sopra menzionati, il protocollo di co-immunoprecipitazione descritto consente il rilevamento di interazioni deboli e / o transitori proteine. Il componente principale di questo protocollo ottimizzato è l'aggiunta di N-etilmaleimmide (NEM) nel tampone di lisi cellulare. NEM è un reagente alchilante che reagisce con i gruppi tiolici liberi come presente in cisteine, a pH 6,5-7,5, per formare una stabile tio-estere(Figura 1). Al più alto pH, NEM può anche reagire con gruppi amminici o subire l'idrolisi 15. NEM è in genere utilizzato per bloccare gruppi tiolo gratuito, al fine di prevenire la formazione di legami disolfuro o inibire l'attività enzimatica. Ad esempio, NEM è spesso usato per bloccare enzimi desumoylating, che sono cisteina proteasi. Nel protocollo co-immunoprecipitazione descritto, NEM è stato inizialmente incluso nel tampone di lisi perché era stato riferito che la sumoilazione delle proteine influenza può influenzare l'interazione tra proteine virali 16. Inaspettatamente, l'aggiunta di NEM rivelata chiave per documentare l'interazione tra influenza NP e mouse Mx1 mediante co-immunoprecipitazione. Non è chiaro perché l'aggiunta di NEM è cruciale per rilevare l'interazione NP-MX1. Forse l'interazione è troppo transitoria e / o debole. NEM potrebbe stabilizzare l'interazione, ad esempio, conservando una specifica conformazione MX1 una proteina virale o anche un terzo compo sconosciutanente. Tale effetto stabilizzante di NEM è stato osservato in precedenza, ad esempio, per l'interazione tra la ribonucleotide reduttasi M1 e la sua gemcitabina inibitore (F2dC) 17. MX1 e NP entrambi contengono più residui di cisteina che potrebbero essere modificati da NEM. Ad esempio, un recente studio condotto da Rennie et al. Hanno dimostrato che un stalkless MxA variante contiene tre residui di solventi cisteina esposti che possono essere modificate da iodoacetamide. Mutando questi residui di serine non ha influenzato l'attività enzimatica di MxA, ma impedisce l'aggregazione disolfuro-mediata 18. Poiché questi cisteine sono conservati in MX1, questo suggerisce che le cisteine analoghe in MX1 possono essere modificati da NEM e come tale influenza la sua conformazione e solubilità. Inoltre, NEM potrebbe anche influenzare l'attività di GTPasi Mx1, che è essenziale per l'attività anti-influenzale di MX1, stabilizzando così l'interazione tra MX1 e NP. Tuttavia, un effetto diretto di NEM sul GTPase actività di Mx1 è improbabile, come NEM è necessario anche per rilevare l'interazione tra l'influenza NP e GTPase mutanti inattivi della proteina Mx1 14. Chiaramente, sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire l'effetto del NEM sull'interazione NP-MX1.
In sintesi, il protocollo di co-immunoprecipitazione descritto consente di studiare l'interazione tra la proteina Mx1 antivirale e il suo bersaglio virale, la proteina influenza NP. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare altre interazioni deboli o transitori che dipendono dalla stabilizzazione specifiche conformazioni proteiche. Interazione proteina-proteina che dipendono conformazioni specifiche sono state descritte in precedenza, ad esempio, per le proteine leganti il calcio come calmodulina 19. Infine, il ruolo benefico di NEM potrebbe essere utilizzato anche in altri metodi che rilevano interazioni proteina-proteina, come saggi co-sedimentazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiare l'interazione tra le proteine antivirali e ai loro obiettivi virale è molto importante per comprendere i dettagli del meccanismo antivirale di queste proteine. Questo può dare nuove intuizioni come i virus ei loro ospiti co-evoluti e sarà la base per lo sviluppo di nuove strategie antivirali. Il protocollo di co-immunoprecipitazione ottimizzata qui descritto consente di studiare l'interazione tra la proteina del mouse MX1 suo bersaglio virale, la proteina influenza NP. L'aspetto più import…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da FWO-Vlaanderen, il progetto IOF IOF10 / stARTT / 027 e Università di Gand Special Research Grant BOF12 / GOA / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
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