임상 적으로 구축 전의 VIVO 모의 백내장 수술 모델

Summary

여기에 설명된 것은 본래의 미세환경 내에서 상피 조직의 손상 반응 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 임상적으로 관련된 생체 외 모의 백내장 수술 모델의 확립입니다.

Abstract

상피 조직이 상처 복구를 수행하는 방법을 이해하는 데 가장 큰 장애물은 생체 내 상피 조직 손상과 밀접하게 모방된 환경에서 생체 외 상처 반응을 추적하고 조작할 수 있는 모델의 가용성이 제한되어 있다는 것입니다. 이 문제는 백내장 수술을 기반으로 임상적으로 관련된 상피 체외 손상 복구 모델을 만들어 해결되었습니다. 이 배양 모델에서는 상처에 대한 수정체 상피의 반응을 세포의 고유 미세환경에서 실시간으로 추적할 수 있으며, 상처 복구의 분자 매개체는 복구 과정에서 쉽게 조작할 수 있습니다. 배양을 준비하기 위해 눈에서 수정체를 제거하고 수정체 앞쪽을 작게 절개하여 수정체 섬유 세포의 내부 덩어리를 제거합니다. 이 절차는 수정체를 둘러싸고 있는 두꺼운 기저막인 수정체 후낭에 원형 상처를 만듭니다. 섬유 세포가 부착된 이 상처 부위는 수술 중에 수정체 캡슐에 연결된 상태로 남아 있는 수정체 상피 세포의 연속적인 단층 바로 옆에 위치합니다. 발달 과정에서 섬유 세포가 파생되는 세포 유형인 상처 입은 상피는 중간엽 전구세포가 수정체¹에 내인성인 비멘틴이 풍부한 복구 세포 집단에 의해 상처 부위를 가로질러 집단적으로 이동함으로써 섬유 세포 제거의 손상에 반응합니다. 이러한 특성은 정상적인 상피 상처 치유 반응의 전형입니다. 이 모델에서는 생체 내에서와 마찬가지로 상처 복구는 이 생체 외 배양 시스템에서 고유하게 유지되는 내인성 환경에서 공급되는 신호에 의존하며, 이는 상처 후 상피의 복구를 조절하는 메커니즘을 발견할 수 있는 이상적인 기회를 제공합니다.

Introduction

임상 적으로, 모의 백내장 수술은, 여기에서 설명한 생체 상피 상처 치유 모델 부상에 응답하여 상피 조직의 복구를 조절 메카니즘을 조사하기위한 도구를 제공하기 위해 개발되었다. 이 모델을 창출을 목적으로 한 주요 기능은 밀접하게 복구 프로세스를 문화 설정, 2), 수리의 규제 요소를 변조의 완화에 부상에 대한 생체 반응을 복제하고 이미지 3) 기능 1) 제공하는 조건을 포함 실시간 전체에서. 과제는, 따라서, 세포의 미세 환경에서 원시 상피 상처 복구를 연구하는 것이 가능시킨 배양 모델을 생성하고 조작하는 것이었다. 이 상처 수리 모델의 유용성은 복구 프로세스를 조절하는 매트릭스 단백질, 사이토 카인 및 케모카인에서 내인성 시그널링 신호를 식별하기위한 새로운 가능성을 연다. 또한, 모델을 조사하기위한 이상적인 방법N 상피 창상 면적 ^2,3-을 다시 epithelialize하는 단체 시트 같이 부상 상피 ⁴ 집단 이주를 연출 기능 감긴 가장자리 간엽 리더 셀의 혈통을 결정하기위한 이동시킬 수있다. 이 모델은 또한 효과적인 상처 치유를 촉진하고 비정상적인 상처 수리 ^(5)을 방지 할 수 치료제를 식별하는 데 사용할 수있는 플랫폼을 제공한다.

가능한 상처....

Protocol

다음 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 방침을 준수합니다.

예 생체 상처 문화 렌즈 1. 설치 및 준비

1. 멸균, 층류 후드 세 100mm 페트리 접시를 놓습니다. 실온에서, 중간 트리스 / 우선 당 버퍼와 배양 접시 두 개를 (140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 0.7 mM의 나 ₂ PO _4, 5 mM의 D-포도당, 8.25 mM 트리스 자료, 염산으로 pH 7.4까지 TD 버퍼)를 입력 세 번째 빈 떠나. 사전 따뜻한 배양 배지를 37 ℃로 ^O (미디어 (199)는, 1 % L- 글루타민 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된)
   참고 : 생체 내에서 발생으로 문화 매체를 치유 표준 상처, 무 혈청이다 그러나, 상처 수복 배양 혈청 또는 다른 인자를 포함 한정 배지 조건에서 성공적으로 성장시킬 수있다.
2. 비옥 한 배아 D를 제거바깥 인큐베이터에서 15 화이트 레그혼 병아리 달걀 (부드러운 락과 37.7 ° C에서 개최)
3. 세척 병에서 층류 후드 70 % 에탄올로 쉘의 깨끗한 외부에서 선택....

Results

예 생체 내 모델은 세포의 기본 미세 환경에서 상처 치유 과정을 연구하기 위해 만들어

세포의 기본 미세 환경 내에서 상피의 상처 치유 조절에 관여하는 메커니즘을 조사하기 위해, 임상 적으로 생체 모의 백내장 수술 모델을 만들었습니다. 이 모델은 그의 고유 특성 때문에 많은 이점을 제공 렌즈 조직으로부터 생성된다 : 1) 렌즈 수정체 낭 불리는 두꺼운 기저막으로 둘러싸여 독립적 기관이다; 2)는 무 혈관성, 3)의 지배를하지 4) 관련 기질 무료입니다. 따라서, 검사 보수 프로세스가 적절한 렌즈 타고난 세포로 제한된다. 이 모델을 만들려면, 렌즈는 배아 (E) 하루 15 병아리 배아 (그림 1A)에서 제거됩니다. 작은 절개 렌즈 섬유 균체가 제거되는 전방 렌즈 캡슐과 연관된 렌즈 상피 세포에서 이루어진다하이드로 용출, 생리 학적으로 관련 상처 (그림 1A)를 생성하는 고전적인 백내장 절.......

Discussion

여기에서는 눈에서 제거한 후 병아리 배아 렌즈에 대해 생체 외 백내장 수술을 수행하는 상처 복구의 배양 모델을 준비하는 기술을 설명합니다. 수정체 상피는 생체 내에서 발생하는 것과 밀접하게 모방되는 복구 과정으로 이 임상적으로 관련된 상처에 반응하고 다른 상피 조직의 상처 복구와 특징을 공유합니다^2,4. 프로토콜은 간단하고 따르기 쉽지만 배아 수정체로 모의 백내장 수술을 수행하려면 배아 수정체의 직경이 약 2mm에 불과하기 때문에 연습을 통해 습득할 수 있는 작은 조직을 다루는 기술을 개발해야 합니다. 백내장 수술 절차는 해부 현미경으로 수행되며, 중요한 기술 단계에는 전낭에 작은 절개를 하고, 수압 용출에 의해 섬유 세포 덩어리를 제거하고, 배양 연구를 위해 고정된 기질에 생 체 외 백내장 수술 후 수정체 조직을 평평하게 할 수 있도록 전방 상피를 추가로 절단하는 것이 포함됩니다. 미세 수술 백내장 수술 절차는 재현성이 높은 상처 부위를 생성하여 손상된 상피가.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
염화나트륨(NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	에서 140mM에서 사용
	Fisher Scientific	P217-500	TD 버퍼
산나트륨(Na2HPO4)	Sigma	S0876	)에서 0.7mM에서 사용
Fisher Scientific	-포도당(덱스트로오스)	D16-500	TD 버퍼 트리스 베이스에서 0.5mM에서 사용
	Fisher Scientific	BP152-1	TD 버퍼 염산에서 8.25mM에서 사용
	Fisher Scientific	A144-500	TD 버퍼를 7.4로 pH 사용
Media 199	GIBCO	11150-059
L-글루타민	Corning/CellGro	25-005-CI	Media199
페니실린/스트렙토마이신	Corning/에서 1%로 사용 CellGro	30-002-CI	Media199
100mm 페트리 접시	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup 필터 유닛	Millipore	SCGPU01RE	살균 여과에 사용
Dumont #5 겸자(2개 필요)	Fine Science Tools	11251-20
35mm 세포 배양 접시	Corning	430165
27G 1ml SlipTip 포함 정밀 글라이드 바늘	BD	309623
파인 가위	파인 사이언스 도구	14058-11
표준 펜치	파인 사이언스 도구	91100-12
기타 필요한 항목: 일반 해부 기구,  비옥한 흰 다리뿔 닭 알, 체크 알 인큐베이터 (가습, 37.7° C), 층류 후드, 쌍안 스테레오비전 해부 현미경