הקמת קלינית רלוונטי<em> Ex Vivo</em> דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

ניתוח הקטרקט הרלוונטי מבחינה קלינית, מדומה, לשעבר vivo מודל ריפוי פצעי אפיתל המתואר כאן פותח כדי לספק כלי לחקר המנגנונים המווסתים את התיקון של רקמות האפיתל בתגובה לפציעה. תכונות עיקריות שנועדו ביצירת מודל זה כלול 1 תנאים) ובלבד שמשוכפלים מקרוב את התגובה בvivo לנפצע בהגדרת תרבות, 2) להקל בויסות אלמנטי הרגולציה של תיקון, ו- 3) יכולת תמונת תהליך התיקון, בשלמותו, בזמן אמת. האתגר, לכן, היה ליצור מודל תרבות שבה ניתן היה ללמוד, ולטפל, לתקן פצע אפיתל במייקרו-הסביבה האם של התאים. הזמינות של מודל פצע-תיקון זה פותחת אפשרויות חדשות לזיהוי רמזי איתות אנדוגני ממטריצת חלבונים, ציטוקינים וכמוקינים המסדירים את תהליך התיקון. בנוסף, המודל אידיאלי לבחינה איךn האפיתל הוא מסוגל לנוע כגיליון קולקטיבי מחדש epithelialize אזור פצע ^2,3, ולקביעת השושלת של תאי מנהיג mesenchymal בשולי הפצע שפועלים בהכוונת ההגירה הקולקטיבית של האפיתל נפצע ^4. מודל זה גם מספק פלטפורמה שעם לזהות תרופות שיכולים לקדם את ריפוי פצע יעיל ולמנוע תיקון פצע חריג ^5.

יש כבר מספר דגמי פצע-תיקון זמינים, הן בתרבות וin vivo, שספק את רוב מה שידוע על תהליך תיקון הפצע היום. במודלים של בעלי חיים פציעה, כגון קרנית ^6-12 ועור ^13-17, יש את ההזדמנות ללמוד את התגובה של הרקמה לפציעתם בהקשר של כל מתווכי התיקון שיכול להיות מעורב בתהליך, כוללים תרומות מ מערכת עצבים כלי דם ו. עם זאת, יש מגבלות למניפולציה של ההתנסותתנאים נפשיים in vivo, וזה עדיין לא ניתן לבצע מחקרי הדמיה של תגובת תיקון in vivo, רציף ולאורך זמן. לעומת זאת, רוב דגמי תרבות במבחנה פצע-תיקון, כגון פצע השריטה, ניתן להשפיע בקלות ואחריו לאורך זמן, אבל חסרים את ההקשר הסביבתי של לימוד ריפוי פצעים ברקמות in vivo. בעוד מודלים vivo לשעבר מציעים את היתרון של לימוד תהליך תיקון פגיעה ברציפות לאורך זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים בשילוב עם היכולת לווסת את הרגולטורים המולקולריים של תיקון בכל נקודה בתהליך זמן, יש כמה דגמים שמתאימים אלה פרמטרים.

כאן מתואר הליך כדי ליצור vivo לשעבר פצע אפיתל מאוד לשחזור ריפוי תרבויות שלשכפל התגובה של רקמת האפיתל לפציעה פיזיולוגית. שימוש בעדשה עובר אפרוח כמקור רקמות, vivo לשעבר MOCניתוח קטרקט k מתבצע. העדשה היא רקמה אידיאלית לשימוש עבור מחקרים אלה שכן הוא בתוך כמוסת קרום במרתף עבה עצמאי, avascular, לא innervated, וללא כל סטרומה קשורה ^18,19. במחלות של בני אדם, ניתוח קטרקט מתייחס לאובדן ראייה עקב עננות של העדשה, וכרוך בהסרת מסת תאי עדשת סיבים, הכוללת את חלק הארי של העדשה. חזון ניתוח קטרקט בעקבות משוחזר באמצעות ההחדרה של עדשה תוך-עינית מלאכותית. ניתוח הקטרקט, באמצעות הסרת תאי סיבים, גורם תגובת פציעה באפיתל העדשה הסמוכה, שמגיב בepithelialization מחדש של האזור האחורי של הקפסולה העדשה שנכבש על ידי תאי הסיבים. בניתוח קטרקט, כמו ברוב תגובות תיקון הפצע, יש לפעמים מתרחש תוצאה חריגה fibrotic לתגובת ריפוי הפצע, הקשורים בהופעתה של myofibroblasts, אשר בעדשה ידועה כאחורי Capsule העננות ^20-22. על מנת ליצור את מודל ריפוי פצע ניתוח קטרקט, ניתוח קטרקט הוא חיקה בעדשות הוסרו מן העין עובר אפרוח לייצר פגיעה פיזיולוגית. הסרת מייקר תוצאות תאי עדשת סיבים באזור פצע עגול מאוד עקבי מוקף תאי אפיתל העדשה. אוכלוסיית תא זה נשארה מחובר היטב לכמוסת הקרום במרתף עדשה והוא נפגע על ידי ההליך כירורגי. תאי האפיתל להעביר על האזור הערום של הקרום במרתף אנדוגני לרפא את הפצע, בראשות אוכלוסייה של תאי mesenchymal vimentin העשיר הידועים בתהליך תיקון תאי מנהיג ^1. בעזרת מודל זה התגובה של האפיתל לפציעה ניתן דמיין בקלות ואחריו עם זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים. התאים נגישים לשינויים בביטוי או ההפעלה של המולקולות צפויות לשחק תפקיד בתיקון פצע. תכונה חזקה של ההוא מודל הוא היכולת לבודד ולחקור שינויי הגירה ספציפית במסגרת ריפוי פצעים. היכולת להכין מספר גדול של תרבויות בגילים תואמות vivo לשעבר ריפוי פצע ללימודים היא יתרון נוסף של מודל זה. לפיכך, מערכת מודל זה מספקת הזדמנות ייחודית ללהפריד מנגנוני תיקון פצע ותרופות מבחן להשפעתם על תהליך ריפוי פצע. מודל ניתוח קטרקט המדומה vivo לשעבר צפוי להיות תחולה רחבה, מתן משאבים קריטיים לחקר מנגנונים של תיקון פציעה.

Protocol

הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת תומס ג'פרסון ועם הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון. 1. התקנה והכנת עדשות לתרבות Ex Vivo פצע הנ?…

Representative Results

Ex Vivo דגם נוצר כדי ללמוד את תהליך ריפוי הפצע במייקרו-הסביבה האם של התאים לחקור מנגנונים מעורבים בויסות ריפוי פצע של האפיתל במייקרו-הסביבה המקומית של התאים, מודל ניתוח קטרקט רלוונטי קליני vivo לשעבר מדומה נוצר. מודל זה נוצר …

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…

Materials

Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at .7mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs,
check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting
microscope