एक नैदानिक प्रासंगिक की स्थापना<em> पूर्व vivo</emएक मूल निवासी Microenvironment में उपकला घाव मरम्मत की जांच के लिए> मॉक मोतियाबिंद सर्जरी मॉडल
Summary
Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.
Abstract
The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.
Introduction
नैदानिक प्रासंगिक, नकली मोतियाबिंद सर्जरी, यहाँ वर्णित पूर्व vivo उपकला घाव भरने मॉडल एक चोट के जवाब में उपकला ऊतकों की मरम्मत को नियंत्रित करने वाले तंत्र की जांच के लिए एक उपकरण प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था। इस मॉडल को बनाने में के लिए उद्देश्य से किया गया है कि मुख्य विशेषताएं, बारीकी से मरम्मत की प्रक्रिया एक संस्कृति की स्थापना, 2), मरम्मत के नियामक तत्व modulating के आराम में लोग घायल हो गए करने के लिए इन विवो प्रतिक्रिया दोहराया और छवि के लिए 3) क्षमता है कि 1) प्रदान शर्तों शामिल वास्तविक समय में अपनी संपूर्णता में। चुनौती है, इसलिए, कोशिकाओं 'देशी microenvironment में, उपकला घाव की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए यह संभव हो गया था, जिसमें एक संस्कृति मॉडल बनाने के लिए, और हेरफेर करने के लिए किया गया था। इस घाव की मरम्मत मॉडल की उपलब्धता की मरम्मत की प्रक्रिया को नियंत्रित करने वाले मैट्रिक्स प्रोटीन, साइटोकिन्स और chemokines से अंतर्जात संकेतन संकेतों की पहचान करने के लिए नई संभावनाओं को खोलता है। इसके अलावा, मॉडल की जांच के लिए आदर्श है कि कैसे एकएन उपकला घाव क्षेत्र 2,3, फिर से epithelialize करने के लिए एक सामूहिक पत्र के रूप में और घायल उपकला 4 की सामूहिक प्रवास के निर्देशन में कार्य करते हैं घाव किनारे पर mesenchymal नेता कोशिकाओं के वंश का निर्धारण करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए सक्षम है। यह मॉडल भी प्रभावी घाव भरने को बढ़ावा देने और न्यायपालिका घाव की मरम्मत 5 रोकने सकता है कि चिकित्सा विज्ञान की पहचान करने के लिए जो के साथ एक मंच प्रदान करता है।
उपलब्ध घाव की मरम्मत के मॉडल की एक संख्या संस्कृति में है और आज घाव की मरम्मत की प्रक्रिया के बारे में जाना जाता है का सबसे प्रदान की है जो इन विवो, दोनों में पहले से ही कर रहे हैं। ऐसे कॉर्निया 6-12 और त्वचा 13-17 के रूप में पशु चोट मॉडल, में, से योगदान सहित प्रक्रिया में शामिल किया जा सकता है कि सभी की मरम्मत मध्यस्थों, के संदर्भ में लोग घायल हो गए करने के लिए ऊतक की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने का अवसर है vasculature और तंत्रिका तंत्र। हालांकि, अनुभव जोड़ तोड़ करने के लिए सीमाएं हैंvivo में मानसिक स्थिति, और यह लगातार समय के साथ, विवो में मरम्मत प्रतिक्रिया के इमेजिंग अध्ययन का संचालन करने के लिए अभी तक संभव नहीं है। इसके विपरीत, इस तरह के खरोंच घाव के रूप में सबसे इन विट्रो घाव की मरम्मत संस्कृति मॉडल, आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है और समय के साथ पीछा किया, लेकिन इन विवो ऊतक में घाव भरने का अध्ययन करने के लिए पर्यावरण के संदर्भ की कमी है। पूर्व vivo मॉडल प्रक्रिया में किसी भी समय बिंदु पर मरम्मत की आणविक नियामकों मिलाना करने की क्षमता के साथ युग्मित 'कोशिकाओं microenvironment के संदर्भ में समय के साथ लगातार चोट की मरम्मत की प्रक्रिया का अध्ययन करने का लाभ प्रदान करते हैं, इन फिट है कि कुछ मॉडल हैं पैरामीटर।
यहाँ एक शारीरिक लोग घायल हो गए करने के लिए एक उपकला ऊतक की प्रतिक्रिया को पुन: पेश संस्कृतियों है कि चिकित्सा अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पूर्व vivo उपकला घाव उत्पन्न करने के लिए एक प्रक्रिया में वर्णित है। एक ऊतक स्रोत, एक पूर्व vivo एमओसी के रूप में लड़की भ्रूण लेंस का प्रयोगकश्मीर मोतियाबिंद सर्जरी प्रदर्शन किया है। लेंस avascular, innervated, और कोई भी संबद्ध स्ट्रोमा 18,19 से मुक्त नहीं है, यह आत्म निहित एक मोटी तहखाने झिल्ली कैप्सूल के भीतर है के बाद से इन अध्ययनों के लिए उपयोग करने के लिए एक आदर्श ऊतक है। मानव रोग में मोतियाबिंद सर्जरी की वजह से लेंस की अपारदर्शन को दृष्टि हानि के पते, और लेंस के थोक शामिल हैं जो लेंस फाइबर सेल जन, को हटाने शामिल है। बाद मोतियाबिंद सर्जरी दृष्टि एक कृत्रिम intraocular लेंस की प्रविष्टि के माध्यम से बहाल है। मोतियाबिंद सर्जरी प्रक्रिया, फाइबर कोशिकाओं को हटाने के माध्यम से, फाइबर कोशिकाओं द्वारा कब्जा कर लिया गया था कि लेंस कैप्सूल के पीछे क्षेत्र के फिर से epithelialization से प्रतिक्रिया करता है जो आसन्न लेंस उपकला में एक चोट प्रतिक्रिया लाती है। मोतियाबिंद सर्जरी में, सबसे घाव की मरम्मत प्रतिक्रियाओं के रूप में, कभी कभी लेंस में पीछे Capsu के रूप में जाना जाता है जो myofibroblasts के उद्भव के साथ जुड़ा हुआ घाव चिकित्सा प्रतिक्रिया करने के लिए एक न्यायपालिका तंतुमय परिणाम, वहाँ होती हैLe अपारदर्शन 20-22। मोतियाबिंद सर्जरी के घाव भरने मॉडल उत्पन्न करने के लिए, एक मोतियाबिंद सर्जरी प्रक्रिया एक शारीरिक चोट का उत्पादन करने के लिए लड़की भ्रूण आंख से हटा लेंस में मजाक उड़ाया जाता है। लेंस उपकला कोशिकाओं से घिरा हुआ एक बहुत ही संगत परिपत्र घाव क्षेत्र में लेंस फाइबर कोशिकाओं के परिणामों के microsurgical हटाने। इस सेल की आबादी मजबूती से लेंस तहखाने झिल्ली कैप्सूल के साथ जुड़ा रहता है और शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया से घायल हो गया है। उपकला कोशिकाओं नेता कोशिकाओं के रूप में 1 की मरम्मत की प्रक्रिया में जाना जाता vimentin अमीर mesenchymal कोशिकाओं की आबादी के नेतृत्व में घाव, चंगा करने के लिए अंतर्जात तहखाने झिल्ली के denuded क्षेत्र पर आ जाते हैं। इस मॉडल के साथ चोट करने के लिए एक उपकला की प्रतिक्रिया आसानी से देखे जा सकते हैं और कोशिकाओं 'microenvironment के संदर्भ में समय के साथ पीछा किया। कोशिकाओं अभिव्यक्ति या घाव की मरम्मत में एक भूमिका निभाने की उम्मीद अणुओं की सक्रियता का संशोधन करने के लिए आसानी से सुलभ हैं। वें में से एक शक्तिशाली सुविधामॉडल अलग है और घाव भरने के ढांचे में माइग्रेशन-विशिष्ट परिवर्तनों का अध्ययन करने की क्षमता है। अध्ययन के लिए आयु वर्ग के मिलान किया पूर्व vivo घाव भरने संस्कृतियों की बड़ी संख्या को तैयार करने की क्षमता इस मॉडल का एक और फायदा है। इस प्रकार, इस मॉडल प्रणाली घाव भरने की प्रक्रिया पर उनके प्रभाव के लिए घाव की मरम्मत के तंत्र और परीक्षण चिकित्सा विज्ञान के अलावा तंग करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। पूर्व vivo नकली मोतियाबिंद सर्जरी मॉडल चोट की मरम्मत के तंत्र के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन उपलब्ध कराने के व्यापक लागू होने की संभावना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at .7mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, | |||
| check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting | |||
| microscope | |||
References
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