臨床的に関連の確立<em>エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための>モック白内障手術モデル
Summary
Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.
Abstract
The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.
Introduction
臨床的に関連する、モック白内障手術は、ここで説明するex vivoでの上皮の創傷治癒モデルは、損傷に応答して、上皮組織の修復を制御する機構を調査するためのツールを提供するために開発されました。このモデルを作成する際にを目的とした主な機能は、1を含む）と密接画像へのカルチャ設定で負傷、2）修理の調節要素を調節のしやすさ、および3）能力修復プロセスへのインビボ応答をレプリケート条件を提供します、その全体を、リアルタイムで。課題は、したがって、細胞のネイティブの微小環境では、上皮創傷修復を研究することが可能とされた培養モデルを作成し、操作することでした。この創傷修復モデルの利用可能性は、修復プロセスを調節するマトリックスタンパク質、サイトカインおよびケモカインからの内因性シグナル伝達の手がかりを識別するための新たな可能性を開きます。また、モデルがどのように検査するための理想的ですnは上皮が創傷領域2,3を 、再上皮化する集団シートとして負傷した上皮4の集団移動を導くで機能創傷端に間葉リーダー細胞の系統を決定するために移動することができます。また、このモデルでは、効果的な創傷治癒を促進し、異常な創傷修復5を防ぐことができる治療薬を同定する際のプラットフォームを提供します。
今日創傷修復プロセスについて知られているものの大部分を提供してきた文化およびin vivoの両方で利用可能な創傷修復モデル、の数が既にあります。このような角膜6-12や皮膚13-17のような動物損傷モデルでは、からの寄与を含むプロセスに関与することができたすべての修復メディエーターの文脈で負傷に組織の反応を研究する機会があります血管系と神経系。しかし、experiを操作するには限界がありますインビボでの精神状態、それが継続的に時間をかけて、in vivoでの修復応答のイメージング研究を行うことがまだ可能ではありません。対照的に、そのようなスクラッチ傷のようなほとんどのインビトロ創傷修復培養モデルは、容易に操作することができ、経時的に追跡が、in vivoでの組織の創傷治癒を研究する環境的文脈を欠いています。 ex vivoでのモデルは、プロセスの任意の時点で修理の分子制御因子を調節する能力と結合し、細胞の微小環境のコンテキスト内で時間かけて連続的に損傷修復過程を研究するという利点を提供するが、これらに適合するいくつかのモデルが存在しますパラメータ。
ここでは、生理的創傷の上皮組織の応答を再現する文化を癒し、再現性の高いex vivoでの上皮の傷を生成する手順を説明します。組織源、 エクスビボ MOCとしてニワトリ胚のレンズを使用しましたk個の白内障手術が行われます。レンズは無血管、神経支配、および関連する間質18,19の自由ではない、それは自己完結型の厚い基底膜カプセル内にあるので、これらの研究のために使用するのに理想的な組織です。ヒト疾患において、白内障手術は、レンズの混濁による視力喪失に対処し、かつレンズの大部分を含むレンズ繊維細胞塊の除去を含みます。次の白内障手術のビジョンは、人工の眼内レンズを挿入することによって復元されます。白内障手術の手順は、繊維細胞を除去して、繊維細胞によって占有されていたレンズカプセルの後部領域の再上皮化することによって応答する各レンズ上皮における損傷応答を誘導します。白内障手術では、ほとんどの傷の修復反応のように、時にはレンズに事後Capsuとして知られている筋線維芽細胞の出現に関連する創傷治癒応答に異常な線維化の成果は、そこに発生しますル混濁20-22。白内障手術創傷治癒モデルを生成するには、白内障手術の手順は、生理学的損傷を生成するためにニワトリ胚の眼から取り出したレンズで模倣されます。レンズ上皮細胞に囲まれた非常に一貫性のある円形の創傷領域のレンズ繊維細胞の結果の顕微除去。この細胞集団は、しっかりとレンズの基底膜カプセルに取り付けられたままであり、外科的処置により負傷されます。上皮細胞は、リーダーセル1として修復プロセスで知られているビメンチン豊富な間葉細胞の集団が率いる傷を癒すために、内因性の基底膜の剥皮領域に移行します。このモデルでは損傷に対する上皮の応答が容易に可視化することができ、細胞の微小環境のコンテキスト内で経時的に追跡しました。細胞は、創傷修復に関与すると予想される分子の発現または活性化の変更に容易にアクセスできます。目の強力な機能モデルは分離し、創傷治癒の枠組みの中でマイグレーション固有の変化を研究する能力です。研究のために熟成一致エクスビボ創傷治癒培養多数を調製する能力は、このモデルの別の利点です。したがって、このモデル系は、創傷治癒プロセスに対するそれらの効果について、創傷修復のメカニズムと試験治療薬を離れていじめるするユニークな機会を提供します。 エキソビボモック白内障手術モデルは損傷修復のメカニズムを研究するための重要なリソースを提供し、幅広い適用性を有することが期待されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at .7mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, | |||
| check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting | |||
| microscope | |||
References
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