الاستقراء وتقييم الإصابة الإسكيمية-ضخه في Langendorff perfused لالجرذ القلوب
Summary
The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.
Abstract
The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.
Introduction
توضيح من الأحداث الكامنة وراء استجابة القلب لكلا نقص التروية وضخه ضرورية في تحسين علاج احتشاء عضلة القلب (1) والقلب العمليات الجراحية التي تتطلب الأبهر عبر تحامل-2. في حين أن النماذج في الجسم الحي من نقص التروية إصابة ضخه تسمح تحليل نقطة النهاية مفيدة جدا، فهي ليست فعالة كما هو الحال لدراسة الآثار الفنية من نقص التروية إصابة ضخه تماما في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى ذلك، في نماذج نقص تروية الجسم الحي ضخه تنتج عادة التباين الكبير في حجم احتشاء، والتسليم المباشر من المخدرات إلى القلب في وقت ضخه يشكل تحديا. الاستفادة من نظام القلب Langendorff معزولة لدراسة إصابة نقص التروية ضخه يسمح في الوقت الحقيقي للتقييم وظيفي من العلاجات الدوائية، منطقة موحدة من الأنسجة محتشية، والتسليم الفوري من الدواء مباشرة إلى عضلة القلب.
وصف لأول مرة بذ أوسكار Langendorff في عام 1895 3، قلب Langendorff معزولة هو نموذج قوي لدراسة نقص التروية إصابة ضخه، بعد أن تم استخدامها في الأبحاث نقص التروية ضخه على مدى السنوات ال 40 الماضية 4،5. هنا، يتم إجراء بعض التعديلات لتحسين قلب معزولة عن التحليل الوظيفي. وفي إقناء؛ إدخال القنية الموقع من الشريان الأورطي في حين أن القلب هو الضرب يضمن أن القلب لا تواجه شروط مسبقة الدماغية، التي من شأنها أن تغير نتائج التجارب نقص التروية ضخه 6. ولتيسير ذلك، يتم تنفيذ عملية القصبة الهوائية، مما يسمح للتهوية وضمان الاستقرار الفسيولوجية للفئران أثناء الجراحة. ثم يرد القلب إلى كوب تغلف عمود الماء دوامة من خلالها يتم تسليم عازلة كريبس هنسلايت عبر نضح الوراء مباشرة في الشريان الأورطي. يتم إدخال بالون مملوء المالحة إلى البطين الأيسر وتعلق على محول الضغط، والذي يسمح لقياس الوقت الحقيقي من الضغوط من داخل لالبطينحساب د المعلمات وظيفية متعددة. في ختام التجربة، يتم مسح قلب مع المياه المالحة الباردة لاعتقال الانكماش وفلاش المجمدة في النيتروجين السائل لتمكين تحليل المصب من مستويات DNA، RNA والبروتين. وبالتالي تعديلها، يخدم قلب Langendorff perfused لكنظام فعال للرصد المباشر من أثر الفسيولوجية التدخلات الدوائية في أي وقت حادة خلال إصابة نقص التروية ضخه.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومعزولة perfused لقلب الفئران يمكن استخدامها بنجاح لدراسة تأثير التدخل الدوائي على شروط مسبقة القلب في نقص التروية إصابة ضخه 9. ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الأساسية إلى الإجراء الذي يجب أن تكون موحدة من أجل ضمان تحقيق نتائج استنساخه. الحفاظ على درجة حرارة 37.4 درجة مئو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا المنشور من قبل البحوث السريرية وبالحركة (SCTR) معهد ساوث كارولينا، مع منزل الأكاديمي في كلية الطب بجامعة ولاية كارولينا الجنوبية، NIH / NCATS غرانت عدد UL1 TR000062. وقدمت المزيد من الدعم من قبل جائزة الجدارة VA BX002327-01 لDRM. وأيد DJH من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCATS غرانت عدد TL1 TR000061 والمعاهد الوطنية للصحة منح عدد T32 GM008716. وأيد SEA قبل المعاهد الوطنية للصحة منح عدد T32 HL07260.
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
- Bainey, K. R., Armstrong, P. W. Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction. American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).
- Beyersdorf, F. The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage. Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).
- Langendorff, O. Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).
- Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).
- Yellon, D. M., et al. The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).
- Khaliulin, I., et al. Temperature preconditioning of isolated rat hearts–a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore. The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).
- Molojavyi, A., et al. Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart). Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).
- Asfour, H., et al. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts. The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA, ., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model. Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).
- Xie, M., et al. Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy. Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).
