Induktion och Bedömning av ischemi-reperfusion skada i Langendorff-perfusion Rat Hearts
Summary
The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.
Abstract
The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.
Introduction
Klarläggande av de händelser som ligger bakom hjärt svar på både ischemi och reperfusion är väsentliga för att förbättra behandling av hjärtinfarkt 1 och hjärtkirurgiska ingrepp som kräver aortatvärkläm 2. Medan in vivo-modeller av ischemi reperfusionsskada tillåter mycket användbar ändpunktsanalys, är de inte lika effektiva för att studera de funktionella effekterna av ischemi reperfusionsskada akut i realtid. Dessutom, i vivo ischemireperfusion modeller producerar i allmänhet betydande variabilitet i infarktstorlek, och direkt leverans av läkemedel till hjärtat vid tidpunkten för reperfusion är en utmaning. Utnyttjandet av en Langendorff isolerade hjärtsystem för att studera ischemi reperfusionsskada möjliggör realtid funktionell bedömning av farmakologisk behandling, likformig yta på infarktvävnad, och momentan avgivning av läkemedel direkt till hjärtmuskeln.
Först beskrivs by Oscar Langendorff 1895 3, är Langendorff isolerade hjärtat en robust modell för att studera ischemireperfusionsskada, har använts i ischemireperfusion forskning under de senaste 40 åren 4,5. Här är några ändringar gjorts för att optimera den isolerade hjärta för funktionell analys. In situ kanylering av aorta medan hjärta slår säkerställer att hjärtat inte uppleva ischemisk prekonditionering, som skulle kunna ändra resultatet av ischemireperfusion studier 6. För att underlätta detta är en trakeotomi utförs, vilket tillåter ventilation och säkerställa fysiologisk stabilitet hos råttan under operation. Hjärtat fästes sedan till en glas vattenmantlad spiral kolonn genom vilken Krebs Henseleit-buffert levereras via retrograd perfusion direkt in i aorta. En saltlösningsfylld ballong införes i den vänstra ventrikeln och kopplad till en tryckomvandlare, som möjliggör realtidsmätning av tryck från insidan av ventrikeln end beräkning av multipla funktionella parametrar. Vid slutet av försöket, är hjärtat spolas med kall saltlösning för att arrestera kontraktion och snabbfrystes i flytande kväve för att möjliggöra nedströms analys av DNA, RNA och proteinnivåer. Sålunda modifierade, tjänar Langendorff perfunderades hjärtat som ett effektivt system för direkt övervakning av den fysiologiska effekten av farmakologiska interventioner som helst akut under ischemireperfusionsskada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den isolerade perfunderade råtthjärta kan med framgång användas för att studera effekten av farmakologisk intervention på hjärt förkonditionering i ischemireperfusionsskada 9. Det finns dock några viktiga steg till förfarandet som måste standardiseras för att säkerställa reproducerbara resultat. Upprätthållande av en temperatur av 37,4 ° C i systemet är kritisk, eftersom även mild hypotermi och hypertermi kan orsaka hjärt förkonditionering 10,11. Den totala tid som förflyter f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna publikation stöddes av South Carolina Clinical & translationell forskning (SCTR) Institute, med en akademisk hem vid den medicinska universiteten av South Carolina, NIH / NCATS licensnummer UL1 TR000062. Ytterligare stöd kom från VA hederspris BX002327-01 till DRM. DJH stöddes av NIH / NCATS Grant Antal TL1 TR000061 och NIH Grant Antal T32 GM008716. SEA stöddes av NIH Grant Antal T32 HL07260.
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
- Bainey, K. R., Armstrong, P. W. Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction. American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).
- Beyersdorf, F. The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage. Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).
- Langendorff, O. Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).
- Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).
- Yellon, D. M., et al. The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).
- Khaliulin, I., et al. Temperature preconditioning of isolated rat hearts–a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore. The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).
- Molojavyi, A., et al. Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart). Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).
- Asfour, H., et al. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts. The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA, ., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model. Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).
- Xie, M., et al. Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy. Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).
