Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères
Summary
We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.
Abstract
When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.
Introduction
Les Gzms sont une famille de serine proteases homologues fortement localisées dans les lysosomes spécialisées des CTL et les cellules NK 1. Les granules cytotoxiques de ces cellules tueuses contiennent également des protéines de la membrane perturbateurs PFN et GNLY qui sont libérés simultanément avec les Gzms lors de la reconnaissance d'une cellule cible destiné à l'élimination 2,3. Il existe cinq Gzms chez l'homme (GZMA, B, H, K et M), et 10 chez des souris (Gzms GZMA – G, K, M et N). GZMA et GZMB sont les plus abondants et largement étudiés chez l'homme et la souris 1. Cependant, des études plus récentes ont commencé à enquêter sur les voies de mort cellulaire ainsi que les effets biologiques supplémentaires induits par les autres, soi-disant Gzms orphelins de la santé et de la maladie 4.
La fonction la plus connue des Gzms, en particulier de GZMA et GZMB, est l'induction de la mort cellulaire programmée dans des cellules de mammifère lorsqu'elle est remise dans les cellules cibles par PFN 5,6. Pourtant, Des études plus récentes ont également démontré des effets extracellulaires des Gzms avec un impact profond sur la réglementation et l'inflammation immunitaire, indépendamment de livraison cytosolique par PFN 7,8. Le spectre de cellules qui sont tuées efficacement cytosolique après l'entrée des Gzms a également été récemment élargie à partir de cellules de mammifères à des bactéries et même 9,10 11 certains parasites. Ces découvertes récentes ont ouvert un nouveau champ pour les chercheurs GZM. Par conséquent, un, à haut rendement système d'expression mammalien rentable solution va considérablement faciliter la voie à ces études futures.
Gzms natives humaines, de souris et de rat ont été purifiés avec succès à partir de la fraction de granulés de CTL et NK lignées cellulaires 14/12. Cependant, dans les mains, le rendement de ces techniques de purification est dans la gamme de culture inférieure à 0,1 mg / L de cellules (observation non publiée et 12). En outre, la résolution chromatographique d'un seul GZM sans contamination par other Gzms et / ou des protéines qui sont également présentes dans les granules contestent (données non publiées et 12,14). Gzms recombinants ont été produites dans des bactéries, des levures 15 16, des cellules d'insectes 17 et même dans des cellules de mammifères telles que HEK 293 18,19. Seuls les systèmes d'expression de mammifères portent le potentiel de produire des enzymes recombinantes avec des modifications post-traductionnelles identiques à la protéine native cytotoxique. Modifications post-traductionnelles ont été impliqués avec l'absorption spécifique par endocytose et la localisation intracellulaire de la protease dans les cellules cibles de 20 à 22. Par conséquent, en utilisant pHLsec 23 (un cadeau genre de Radu Aricescu et Yvonne Jones, Université d'Oxford, Royaume-Uni) comme l'épine dorsale de plasmide pour l'expression GZM, nous avons établi un système simple, rapide et économique efficace pour la production de protéines à haut rendement dans des cellules HEK293T. pHLsec combine un activateur de CMV avec un promoteur de poulet Β-actine; Ensemble, ces éléments démonstrationsted la plus forte activité de promoteur dans diverses lignées cellulaires 24. En outre, le plasmide contient un Β-globine de lapin intron, des signaux de sécrétion et de Kozak optimisée, une 6xHis-tag-Lys et un signal poly-A. Les inserts peuvent être clonées idéalement entre le signal de sécrétion et la-6xHis-tag Lys (Figure 1) assurer une expression optimale et l'efficacité de la sécrétion de protéines dépourvues appropriées domaines N-terminaux. Pour l'expression des Gzms, nous avons remplacé la séquence signal de sécrétion endogène avec le signal de sécrétion fournie par le vecteur suivie par une entérokinase (EK) place (DDDDK) afin que le traitement EK activé le Gzms sécrétées (Gzms actifs commencer par la N-terminal séquence d'acides aminés IIGG 25). De plus en faveur de cette méthode, les cellules HEK293T se développent rapidement en basse à prix moyen, comme milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), et sont bien adaptés pour la méthode de transfection au phosphate de calcium rentable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le rôle classique et d'études approfondies et de GZMA GZMB est l'induction de l'apoptose dans des cellules de mammifères après leur livraison cytosolique de la protéine formant des pores PFN 1. Récemment, le spectre des Gzms cytotoxique a été élargi de façon significative à partir de cellules de mammifères à 9,10 bactéries, ainsi qu'à 11 certains parasites. En outre, les fonctions, extracellulaires non-classiques de GZMA et GZMB ainsi que la signification b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5ml-column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml-column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
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