Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.
Avgrensing av en celles ultrastructure er viktig for å forstå dens funksjon. Dette kan være en skremmende prosjekt for sjeldne celletyper som spredes gjennom vev laget av ulike celletyper, som for eksempel enteroendocrine cellene i tarm epitel. Disse gastrointestinale sensorer av mat og bakterier har vært vanskelig å studere fordi de er dispergert blant de epitelceller i et forhold på 1: 1000. Nylig har transgene mus reporter blitt generert for å identifisere enteroendocrine celler ved hjelp av fluorescens. En av disse er peptid YY-GFP mus. Ved hjelp av denne musen, har vi utviklet en metode for å relatere konfokal og serie blokk-ansikt scanning elektronmikroskopi. Vi kalte metoden cocem3D og brukt den til å identifisere en bestemt enteroendocrine celle i vev og avsløre cellenes ultrastructure i 3D. Oppløsningen av cocem3D er tilstrekkelig til å identifisere organ så liten som sekretoriske vesikler og å skille cellemembraner for volum rendering. Cocem3D kan enkelt tilpasses for å studere 3D ultrastructure andre spesifikke celletyper i sitt eget vev.
Livet i en celle finner sted i tid og rom. Endringer over tid er ofte studert ved hjelp av time-lapse mikros kombinert med fluorescens imaging teknikker, som super-oppløsning mikroskopi. Plass, særlig anordningen av organeller i en celle eller celle-til-celle-interaksjoner, kan bare være avledet av en fullstendig redegjørelse for cellens finstruktur. En omfattende redegjørelse for en celle fin struktur kan også bringe klarhet i genomisk funksjon i tilfeller hvor genomet er tilgjengelig, som C. elegans nematode en eller flat placozoa tricoplax adherens to. Serial seksjonering elektronmikroskopi er nå en reproduserbar, tidseffektiv, og mindre kostbar oppgave takket være utviklingen av automatiserte 3D elektronmikros teknologier, som serie blokk-ansikt scanning elektronmikros 3 (SBEM).
Behovet for strukturell informasjon for å belyse funksjonen er meget tydelig i visse celtyper l hvor funksjonen avhenger av fysiske celle-til-celle-vekselvirkninger, så som neuroner, gliaceller, eller sensoriske epitelceller. Vi er spesielt interessert i å belyse hvordan sensoriske signaler fra næringsstoffer i lumen av tarmen blir omformet til et elektrisk signal som til slutt modulerer appetitive atferd. Kretsen er kompleks, men begynner i veggen av tarmen hvor næringsstoffene kommer i kontakt med sensoriske epitelceller, kalt enteroendocrine celler. I motsetning til andre sensoriske epitelceller, slik som smaks celler, enteroendocrine cellene dispergert i tarmepitelet i et forhold på 1 til 1000 4-7. Derfor har de vært vanskelig å identifisere og studere, og for lang tid de ble sett på bare som en kilde til gut hormoner. Men med utviklingen av celle-spesifikke fluorescens rapportør mus, komplekset sensorisk funksjon av disse cellene dukker opp. Bruker en av disse reporter mus, et peptid YY-GFP (PyyGFP) mus, fant vi at enteroendocrine celler har en fremtredende cytoplasmatiske hale som vi heter neuropod. Utseendet av neuropods foreslått en konservert funksjon i celle-til-celle-kommunikasjon. Således begrunnet vi at ved å dokumentere den ultra av en enteroendocrine celle, kan funksjonen til neuropods utledes.
Behovet for å forstå strukturen av et vedheng i en dispergert celle som er vanskelig å identifisere var den viktigste begrunnelsen for å utvikle en metode for å kombinere konfokal mikroskopi og SBEM. Cellen av interesse ble identifisert ved hjelp av PyyGFP enteroendocrine celle-spesifikke reporter mus. Metoden tillater oss å dokumentere hele ultrastructure av en enteroendocrine celle og dens neuropod. Innenfor neuropods, fant vi strukturelle trekk ved nevronale aksoner, og utenfor neuropods, fant vi et fysisk forhold til ente gliaceller 8. Faktisk neuropods inneholder ca 70% av alle sekretoriske vesikler som antyder en viktig rolle i den sekretoriske funksjon av disse cellene. Bygger påstrukturelle data i den senere tid har vi funnet at gjennom disse neuropods, enteroendocrine celler og nevroner innervating tarmen danner en neuroepithelial krets, lik som smaks celler i tungen 8,9.
Avdekke slike funksjoner av gastrointestinale chemosensory mekanismer stammet fra strukturelle data samlet inn ved hjelp av denne samsvarmikros metoden. Vi tror at denne metoden kan være nyttig i andre områder av cellebiologi, særlig hvor cellene er dispergert i vev ved et meget lavt forhold. Vi referert til den metode som er korrelative konfokal og serieblokkflate scanning elektronmikroskopi i 3D (Cocem3D). Metoden består av følgende hovedtrinn: vev disseksjon, konfokalmikroskopi, SBEM bildebehandling, SBEM og confocal bilde korrelasjon, og manuell segmentering. Sammenlignet med andre korrelative metoder, er konseptet ganske enkelt fordi korrelasjonen er fysisk snarere enn kjemisk.
Gastrointestinal chemosensation fremstår som et spennende nytt felt i biomedisinsk forskning. Dette er i stor del på grunn av oppdagelsen av funksjonelle smaksreseptorer i enteroendocrine celler 18. Senere studier har vist at enteroendocrine celler uttrykker spesifikke reseptorer for næringsstoffer, inkludert karbohydrater, lipider og aminosyrer 5,6,19,20. Den katalytiske faktor for disse funn har vært utviklingen av rapportør mus, hvori enteroendocrine cellene er fluorescensmerket 20. Vi har utviklet en av disse mus, er PyyGFP mus, for å studere enteroendocrine celler av den distale tynntarm og tykktarm 17,21. Disse cellene er av interesse fordi de skiller ut PYY og glukagon-lignende peptid 1, som begge er indusere av metthet 22,23. På den tiden en komplett ultra-strukturelle hensyn til disse cellene var mangler, som vi mente var avgjørende for å forstå deres signalmekanismer.
ontent "> Her har vi beskrevet et visuelt en metode for å bygge bro konfokalmikroskopi med SBEM. Metoden omtales som Cocem3D, som tillot oss å dokumentere hele ultrastructure av enteroendocrine celler. Vi har rapportert at disse cellene har en neuropod som inneholder tre fjerdedeler av alle de sekretoriske vesikler 8. Innenfor neuropod, er det nevrofilamenter og mye som nevrale aksoner, er neuropods oppfostret av ente gliacellene 8. Viktigere er det om disse neuropods at enteroendocrine celler fysisk koble til nevroner innervating tarmen og kolon 9.En av styrkene til cocem3D er dens enkelhet. Reduksjon av vevsprøve til en blokk som kan avbildes ved konfokal og SBEM letter identifikasjon av en bestemt celle i et vev. Sekretoriske vesikler og andre organeller kan identifiseres med letthet med en oppløsning på 7 nm / pixel. Fordi seksjonene i SBEM ignorert, ytterligere prosesssynge av vev for å identifisere spesifikke proteiner er ikke et alternativ på dette punktet. Imidlertid har utviklingen av metoder som ATUM 24, i hvilke deler fra vevet blokken er bevart, er sannsynlig å muliggjøre identifisering av spesifikke proteiner i cellen. Fastsette den konkrete plasseringen av chemosensory reseptorer på enteroendocrine celler er viktig informasjon for utvikling av medisinsk behandling for fedme, fordi enteroendocrine celler er en sensorisk grensesnitt mellom mat i tarmen og metthetsfølelse i hjernen.
The authors have nothing to disclose.
Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.
Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
Postively charged glass slides and coverslips | |||
Fine art paintbrush #1 | |||
Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
3view system | Gatan | ||
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
Fiji software | Open access software | ||
Computer station with 16GB of RAM or more | |||
Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |