Vi beskriver en immunhistokemisk protokol til at studere profilen af hippocampus neuron aktivering efter udsættelse for en rumlig opgave læring i en musemodel præget af kognitive underskud neurologisk oprindelse. Denne protokol kan anvendes til genetiske eller farmakologiske musemodeller begge karakteriseret ved kognitive underskud.
Induktion af phosphoryleret ekstracellulær-regulerede kinase (pERK) er en pålidelig molekylær udlæsning af læring-afhængig neuronal aktivering. Her beskriver vi et frynsegode immunhistokemi protokol til at studere profilen af hippocampus neuron aktivering efter udsættelse for en rumlig opgave læring i en musemodel præget af kognitive underskud neurologisk oprindelse. Konkret vi brugte pERK immunfarvning at studere neuronal aktivering efter Morris water maze (MWM, en klassisk hippocampus-afhængig læring opgave) i Engrailed-2 knockout (En2 – / -) mus, en model af autisme spektrum forstyrrelser (ASF). I forhold til vildtype (WT) kontroller, En2 – / – mus viste signifikante rumlige læring underskud i MWM. Efter MWM, blev påvist signifikante forskelle i antallet af pERK-positive neuroner i hippocampus specifikke underfelter af En2 – / – mus sammenlignet med WT dyr. Således kan vores protokol håndfast detektere forskelle ipERK-positive neuroner, der er forbundet til hippocampus-afhængig indlæring nyrefunktion i en musemodel af ASD. Mere generelt kan vores protokol anvendes til at undersøge profilen af hippocampale neuron aktivering i genetiske eller farmakologiske musemodeller begge karakteriseret ved kognitive mangler.
Neurologiske lidelser omfatter en bred og heterogen gruppe af lidelser, såsom Downs syndrom, fragilt X syndrom (FXS), Rett syndrom, neurofibromatosis, knolde sklerose og ASD, hvor udviklingen og modningen af centralnervesystemet (CNS) er forstyrret tidligt under prænatal perioden 1.. Disse udviklingsmæssige hjerne dysfunktioner kan forårsage dybe, livslang effekter på motorik, sprog, indlæring og hukommelse proces. Et væld af genetiske og miljømæssige faktorer er blevet impliceret i patogenesen af neurologiske lidelser i de seneste par år 2,3. Selv om de molekylære mekanismer bag den kliniske fænotype forbliver ukendte, har de ovennævnte konstateringer muliggjorde udviklingen af adskillige musemodeller for disse lidelser. Indlærings- og hukommelsessvigt er blevet identificeret i en række af disse musemodeller såsom TSC1 +/-, TSC2 +/-,NF1 +/- og En2 – / – mus 2,4-7. En vigtig udfordring i forbindelse med forstyrrelser i nervesystemets udvikling er identifikationen af cellulære og molekylære processer bag hukommelse og læring dysfunktion. Udvalgte signalveje aktiveres under indlæring eller hukommelse kan inducere transkription af specifikke gener og endelig føre til de novo-proteinsyntese. Umiddelbare-tidlige gener (IEGs) aktivering og protein-afhængige synaptiske modifikationer hurtigt induceret i hjernens neuroner som reaktion på neuronal aktivitet og adfærdsmæssige uddannelse 8,9.
Underskud i signalveje, der involverer neurofibromin er blevet forbundet med nedsat læring i neurologiske lidelser. Neurofibromin er produktet af NF1 genet, hvis mutation forårsager neurofibromatosis type 1, en kompleks genetisk syndrom karakteriseret ved nervesystemet tumorer, adfærdsmæssige og motoriske forsinkelser og kognitiv DISApligtelser 10. Mus heterozygot for NF1 sletning begrænset til hæmmende neuroner viser underskud i den tidlige fase af langsigtet potensering (LTP), samt kompromitteret rumlig indlæring i MWM 5,11,12. Interessant NF1 mangel i denne musemodel fører til en over-aktivering af Ras-signalering i inhibitoriske interneuroner under indlæring, hvilket resulterer i øget ERK phosphorylering og endelig i en unormal forøgelse af GABA-frigivelse fra disse neuroner 5.
Baseret på disse resultater, visualiseringen af neuronal aktivitet efter adfærdsmæssige opgaver repræsenterer en måde til at rekonstruere bestemte kredsløb, der er involveret i neurologiske sygdomme. Den immunhistokemi-protokollen beskrevet her har til formål at vurdere og kvantificere hippocampus ERK phosphorylerings- niveauer efter MWM i ASF musemodel med kognitive mangler. MWM er almindeligt anvendt til at undersøge hippocampus afhængige rumlig indlæring og hukommelse hos gnavere 13,14 </sop>. Vi beslutter at bruge ERK fosforylering som molekylær udlæsning af opgaven afhængige hippocampus læring, da ERK blev vist at have en væsentlig rolle i indlæring og hukommelse dannelse 15. Desuden er det nødvendigt for erfaring-afhængig plasticitet i det udviklende visuelle cortex 16 ERK-vejen. Endelig mus, som mangler en af de to ERK isoformer (ERK2) i CNS udviser markante uregelmæssigheder i kognitive, emotionelle og sociale adfærd 17, hvilket indikerer, at ERK-signalering kan spille en kritisk rolle i patogenesen af neurologiske lidelser, såsom ASD.
Vi brugte Engrailed 2 knockout (En2 – / -) mus som en model for neurologiske lidelser. En2 – / – mus viser anatomiske og adfærdsmæssige "ASD-lignende" funktioner, herunder tab af forhjernen interneuroner 18, reduceret ekspression af ASD-relaterede gener 19, nedsat selskabelighed, og nedsat kognitiv fleksibilitet 6,7,20. Rumlig learning og hukommelse defekter, såsom dem fundet i MWM, er særligt robust i En2 – / – mus 6,7 og kan være relevante for de kognitive svækkelser observeret i ASD patienter 21. Endvidere viste vi, at svækket rumlig indlæring i MWM er forbundet med reduceret neurofibromin udtryk og øget frynsegode niveauer i hilus af En2 – / – voksne mus 7. Her præsenterer vi den detaljerede protokol for den immunhistokemiske karakterisering af pERK følgende MWM i denne ASD musemodel.
Her giver vi et frynsegode immunhistokemi protokol for at afsløre neuronal aktivering efter MWM i En2 – / – mus, en musemodel af neurologiske lidelser. Nedsatte niveauer af pERK blev påvist i CA3 underfelt af En2 – / – mutanter i forhold til WT. Til forskel fra, hvad der observeres i CA3 delfelt, en generel stigning på pERK-positive neuroner blev i stedet fundet i både hilus og GCL af En2 – / – mus i forhold til WT. En mulig forklaring på denne modsatte tendens i ERK fosforylering n…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke det administrative personale i CIBIO (University of Trento) og CNR Neuroscience Institute for assistance. Giovanni Provenzano understøttes af en ph.d.-stipendium fra Fondazione Veronesi (Milano, Italien). Dette arbejde blev finansieret af det italienske ministerium for universiteter og forskning (PRIN 2008 tilskud # 200894SYW2_002 og PRIN 2010-2011 tilskud # 2010N8PBAA_002 til YB), University of Trento (CIBIO opstart tilskud til YB) og Telethon Foundation (tilskud # GGP13034 til YB).
EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
ddH2O | |||
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |