Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders
Summary
We beschrijven een immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Dit protocol kan worden toegepast op zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.
Abstract
Inductie van gefosforyleerd extracellulair gereguleerde kinase (pERK) is een betrouwbare moleculaire uitlezing van leren-afhankelijke neuronale activering. Hier beschrijven we een extraatje immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Specifiek, gebruikten we pERK immunokleuring neuronale activering volgende Morris water maze (MWM, een klassiek hippocampus-afhankelijke leertaak) in Engrailed-2 knockout (En2 – / -) muizen te bestuderen, een model van autisme spectrum stoornissen (ASS). In vergelijking met wild-type (WT) controles, En2 – / – muizen toonde significante tekorten ruimtelijke leren in de MWM. Na MWM, werden significante verschillen in het aantal pERK-positieve neuronen gedetecteerd in bepaalde hippocampus van En2 – / – muizen in vergelijking met WT dieren. Zo kan ons protocol stevig detecteren verschillenpERK-positieve neuronen gekoppeld aan hippocampus-afhankelijk leren impairment in een muismodel van ASD. Meer algemeen kunnen ons protocol worden toegepast om het profiel van hippocampale neuronen activatie onderzoeken zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.
Introduction
Neurologische stoornissen omvatten een grote en heterogene groep van aandoeningen zoals het syndroom van Down, fragiele X syndroom (FXS), Rett syndroom, neurofibromatosis, tubereuze sclerose en ASD, waarin de ontwikkeling en rijping van het centrale zenuwstelsel (CNS) vroeg wordt verstoord tijdens de prenatale periode 1. Deze ontwikkelingsstoornissen hersenen dysfuncties kunnen ingrijpende, levenslange effecten op de motorische functie, taal, leren en geheugen proces veroorzaken. Een grote verscheidenheid van genetische en omgevingsfactoren zijn betrokken bij de pathogenese van neurologische stoornissen in de afgelopen jaren 2,3. Hoewel de moleculaire mechanismen waardoor klinisch fenotype nog steeds onbekend zijn bovengenoemde bevindingen kunnen ontwikkelen verschillende muismodellen van deze aandoeningen. Leer- en geheugenstoornissen zijn geïdentificeerd in een aantal van deze muizenmodellen als Tsc1 +/-, TSC2 +/-,NF1 +/- en En2 – / – muizen 2,4-7. Een belangrijke uitdaging op het gebied van neurologische ontwikkelingsstoornissen is de identificatie van cellulaire en moleculaire processen die het geheugen en het leren dysfunctie. Geselecteerde signaalwegen tijdens het leren of het geheugen geactiveerd kan de transcriptie van specifieke genen induceren en uiteindelijk leiden tot de novo eiwitsynthese. Direct-vroege genen (IEG 's) activering en proteïne-synaptische veranderingen snel geïnduceerd in de hersenen neuronen in reactie op neuronale activiteit en gedragstraining 8,9.
Tekortkomingen in signaleringspaden, die bij neurofibromin zijn geassocieerd met leerstoornissen in ontwikkelingsstoornissen. Neurofibromin is het product van de NF1 gen, waarvan de mutatie veroorzaakt neurofibromatose type 1, een complexe genetische syndroom gekenmerkt door tumoren van het zenuwstelsel, gedrags- en motorische vertragingen en cognitieve disalijkheden 10. Muizen heterozygoot voor Nf1 verwijdering beperkt tot remmende neuronen tonen tekorten in de vroege fase van langetermijnpotentiëring (LTP), evenals het gedrang ruimtelijke leren in MWM 5,11,12. Interessant Nf1 deficiëntie in dit muismodel leidt tot een te activatie van Ras signaling in remmende interneuronen tijdens het leren, wat resulteert in verhoogde ERK fosforylatie en uiteindelijk in een abnormale verhoging van GABA afgifte van deze neuronen 5.
Op basis van deze bevindingen is de visualisatie van de neuronale activiteit na gedragstaken een middel is om specifieke circuits betrokken bij neurologische ziekten reconstrueren. De immunohistochemie protocol hier beschreven is bedoeld om te beoordelen en te kwantificeren hippocampus ERK fosforylering niveaus na MWM in een ASD muismodel met cognitieve tekorten. MWM wordt op grote schaal gebruikt om de hippocampus afhankelijk ruimtelijk leren en geheugen bij knaagdieren 13,14 onderzoeken </sup>. We besluiten ERK fosforylatie als moleculaire uitlezen van task-afhankelijke hippocampus leren, aangezien ERK werd aangetoond dat het een essentiële rol bij leren en geheugenvorming 15 hebben. Bovendien is de ERK-route noodzakelijk ervaringsafhankelijke plasticiteit in de ontwikkelende visuele cortex 16. Tenslotte, muizen die één van de beide ERK isovormen (ERK2) in het CNS vertonen opmerkelijke afwijkingen in cognitieve, emotionele en sociale gedrag 17, wat aangeeft dat ERK signalerende een cruciale rol kan spelen bij de pathogenese van neurologische aandoeningen zoals ASS.
We gebruikten Engrailed 2 knockout (En2 – / -) muizen als een model van neurologische aandoeningen. En2 – / – muizen tonen anatomische en gedragsproblemen "ASD-achtige" functies, waaronder het verlies van voorhersenen interneuronen 18, verminderde expressie van ASD-gerelateerde genen 19, verminderde gezelligheid, en verminderde cognitieve flexibiliteit 6,7,20. Ruimtelijke Learning en geheugenstoornissen, zoals gedetecteerd MWM, bijzonder robuust En2 – / – muizen en 6,7 kan de cognitieve stoornissen waargenomen bij patiënten ASS 21 relevant zijn. Verder toonden we aan dat een verminderde ruimtelijke leren in MWM wordt geassocieerd met een verminderde neurofibromin expressie en verhoogde pERK niveaus in de hilus van En2 – / – volwassen muizen 7. Hier presenteren we de gedetailleerde protocol voor de immunohistochemische karakterisering van pERK volgende MWM in dit ASD muismodel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieden we een extraatje immunohistochemie protocol voor het openbaren van neuronale activering volgende MWM in En2 – / – muizen, een muismodel van neurologische aandoeningen. Verminderde niveaus van pERK werden gedetecteerd in de CA3 deelgebied van En2 – / – mutanten in vergelijking met WT. Anders dan wat waargenomen in CA3 subveld, een algemene verhoging van pERK-positieve neuronen in plaats gedetecteerd in zowel hilus en GCL van En2 – / – muizen in vergelijking met WT. Een mogelij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen het administratief personeel van CIBIO (Universiteit van Trento) en CNR Neuroscience Institute bedanken voor hulp. Giovanni Provenzano wordt ondersteund door een post-doctorale beurs van Fondazione Veronesi (Milaan, Italië). Dit werk werd gefinancierd door het Italiaanse ministerie van Universiteit en Researchcentrum (PRIN 2008 subsidie # 200894SYW2_002 en PRIN 2010-2011 subsidie # 2010N8PBAA_002 tot YB), Universiteit van Trento (CIBIO startsubsidie om YB) en Telethon Foundation (subsidie # GGP13034 aan YB).
Materials
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O’Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
