Neurodevelopmental विकार की एक माउस मॉडल में स्थानिक सीखने के बाद Hippocampal न्यूरॉन गतिविधि के immunohistochemical दृश्य
Summary
हम neurodevelopmental मूल के संज्ञानात्मक घाटे द्वारा विशेषता एक माउस मॉडल में एक स्थानिक शिक्षण कार्य करने के लिए जोखिम के बाद हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन सक्रियण के प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक immunohistochemistry प्रोटोकॉल का वर्णन। इस प्रोटोकॉल संज्ञानात्मक घाटे द्वारा विशेषता दोनों आनुवंशिक या औषधीय माउस मॉडल को लागू किया जा सकता है।
Abstract
Phosphorylated कोशिकी विनियमित काइनेज (पर्क) की प्रेरण सीखने पर निर्भर न्यूरोनल सक्रियण के एक विश्वसनीय आणविक readout है। यहाँ, हम neurodevelopmental मूल के संज्ञानात्मक घाटे द्वारा विशेषता एक माउस मॉडल में एक स्थानिक शिक्षण कार्य करने के लिए जोखिम के बाद हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन सक्रियण के प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक लाभ यह है कि immunohistochemistry के प्रोटोकॉल का वर्णन। चूहों, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों का एक मॉडल (एएसडी) विशेष रूप से, हम मॉरिस पानी भूलभुलैया Engrailed -2 नॉकआउट में (MWM, एक शास्त्रीय हिप्पोकैम्पस पर निर्भर शिक्षण कार्य) – (- / En2) निम्न न्यूरोनल सक्रियण अध्ययन करने के लिए बोनस है कि immunostaining के लिए इस्तेमाल किया। जंगली प्रकार (WT) नियंत्रण की तुलना के रूप में, En2 – / – चूहों MWM में महत्वपूर्ण स्थानिक सीखने घाटे से पता चला है। गुम्मट जानवरों की तुलना में, चूहों – / – MWM के बाद, लाभ यह है कि पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या में काफी अंतर विशिष्ट हिप्पोकैम्पस En2 के उपक्षेत्रों में पता चला रहे थे। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल मजबूती में अंतर का पता लगाने कर सकते हैंअसद के एक माउस मॉडल में हिप्पोकैम्पस-निर्भर सीखने हानि के लिए जुड़े लाभ यह है कि पॉजिटिव न्यूरॉन्स। आम तौर पर, हमारे प्रोटोकॉल संज्ञानात्मक घाटे द्वारा विशेषता दोनों आनुवंशिक या औषधीय माउस मॉडल में हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन सक्रियण का प्रोफाइल की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
Neurodevelopmental विकारों ऐसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास और परिपक्वता के दौरान जल्दी परेशान है जिसमें डाउन सिंड्रोम, नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS), Rett सिंड्रोम, neurofibromatosis, tuberous काठिन्य और एएसडी, जैसे विकारों की एक विस्तृत और विषम समूह में शामिल जन्म के पूर्व की अवधि 1। इन विकास मस्तिष्क रोग मोटर समारोह, भाषा, सीखने और स्मृति की प्रक्रिया पर गहरा, आजीवन प्रभाव पैदा कर सकता है। आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के ढेर सारे पिछले कुछ वर्षों के दौरान 2,3 neurodevelopmental विकारों के रोगजनन में फंसाया गया है। नैदानिक फेनोटाइप अंतर्निहित आणविक तंत्र अनजान रहते हैं यहां तक कि अगर, उपर्युक्त निष्कर्षों को इन विकारों के कई माउस मॉडल के विकास की अनुमति दी है। सीखने और स्मृति घाटे +/- ऐसे Tsc1 +/-, TSC2 के रूप में इन माउस मॉडल की एक संख्या में पहचान की गई है,NF1 +/- और En2 – / – चूहों 2,4-7। Neurodevelopmental विकार के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण चुनौती सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं स्मृति अंतर्निहित और शिथिलता सीखने की पहचान है। सीखने या स्मृति के दौरान सक्रिय चयनित संकेत दे रास्ते विशिष्ट जीन का प्रतिलेखन प्रेरित और अंततः डी नोवो प्रोटीन संश्लेषण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। तत्काल-जल्दी जीन (IEGs) सक्रियण और प्रोटीन पर निर्भर सिनेप्टिक संशोधनों तेजी neuronal गतिविधि और व्यवहार प्रशिक्षण 8,9 के जवाब में मस्तिष्क न्यूरॉन्स में प्रेरित कर रहे हैं।
Neurofibromin को शामिल रास्ते संकेतन में घाटा neurodevelopmental विकारों में बिगड़ा सीखने के साथ संबद्ध किया गया है। Neurofibromin जिसका उत्परिवर्तन neurofibromatosis टाइप 1, एक जटिल आनुवंशिक सिंड्रोम तंत्रिका तंत्र ट्यूमर, व्यवहार और मोटर देरी, और संज्ञानात्मक ईंट द्वारा विशेषता का कारण बनता है NF1 जीन का उत्पाद है,bilities 10। निरोधात्मक न्यूरॉन्स के लिए प्रतिबंधित NF1 हटाए जाने के लिए चूहों विषमयुग्मजी MWM 5,11,12 में दीर्घकालिक potentiation के प्रारंभिक चरण (एलटीपी), और साथ ही साथ छेड़छाड़ की स्थानिक सीखने में घाटा दिखा। दिलचस्प है, इस माउस मॉडल में NF1 कमी वृद्धि हुई ERK फास्फारिलीकरण में और अंत में इन न्यूरॉन्स 5 से गाबा रिहाई की एक असामान्य वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप, सीखने के दौरान निरोधात्मक interneurons में रास संकेतन के एक से अधिक सक्रियण की ओर जाता है।
इन निष्कर्षों के आधार पर, व्यवहार कार्यों के बाद neuronal गतिविधि के दृश्य neurodevelopmental रोगों में शामिल विशिष्ट सर्किट के पुनर्निर्माण के लिए एक तरह से प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ वर्णित immunohistochemistry के प्रोटोकॉल का आकलन और संज्ञानात्मक घाटे के साथ एक असद माउस मॉडल में MWM निम्नलिखित हिप्पोकैम्पस ERK फास्फारिलीकरण के स्तर यों के लिए करना है। MWM व्यापक रूप से कृन्तकों 13,14 में हिप्पोकैम्पस निर्भर स्थानिक सीखने और स्मृति की जांच के लिए प्रयोग किया जाता है </s> ऊपर। हम ERK सीखने और स्मृति गठन के 15 में एक आवश्यक भूमिका है दिखाया गया था, के बाद से काम पर निर्भर हिप्पोकैम्पस सीखने की आणविक readout के रूप में ERK फास्फारिलीकरण का उपयोग करने का फैसला। इसके अलावा, ERK मार्ग विकासशील दृश्य प्रांतस्था 16 में अनुभव पर निर्भर नमनीयता के लिए आवश्यक है। अंत में, सीएनएस शो में दो ERK isoforms (ERK2) में से एक की कमी चूहों ERK संकेतन ऐसे एएसडी के रूप में neurodevelopmental विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है यह दर्शाता है कि, संज्ञानात्मक, भावनात्मक और सामाजिक व्यवहार को 17 में विसंगतियों को चिह्नित किया।
Neurodevelopmental विकारों की एक मॉडल के रूप में चूहों (- – / En2) हम Engrailed 2 पीटकर इस्तेमाल किया। En2 – / – चूहों अग्रमस्तिष्क interneurons 18 के नुकसान सहित शारीरिक और व्यवहार "असद की तरह" सुविधाओं, एएसडी से संबंधित जीन 19 से कम अभिव्यक्ति दिखाने के लिए, सुशीलता कमी आई है, और बिगड़ा संज्ञानात्मक लचीलापन 6,7,20। स्थानिक learniएनजी और इस तरह के MWM में पाया उन के रूप में स्मृति दोष, En2 में विशेष रूप से मजबूत कर रहे हैं – / – चूहों 6,7 और एएसडी रोगियों 21 में मनाया संज्ञानात्मक क्षति के लिए प्रासंगिक हो सकता है। / – – वयस्क चूहों 7 इसके अलावा, हम MWM में बिगड़ा स्थानिक सीखने कम neurofibromin अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है और En2 की hilus में पर्क का स्तर बढ़ जाता है कि पता चला है। यहाँ हम इस एएसडी माउस मॉडल में MWM निम्नलिखित पर्क के immunohistochemical लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
/ – – चूहों, neurodevelopmental विकारों की एक माउस मॉडल यहाँ, हम न्यूरोनल En2 में MWM निम्नलिखित सक्रियण खुलासा करने के लिए एक लाभ यह है कि immunohistochemistry के प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। / – – पर्क की कमी का स्तर En2 के सीए 3 subfield मे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सहायता के लिए CIBIO (ट्रेंटो के विश्वविद्यालय) और सीएनआर तंत्रिका विज्ञान संस्थान के प्रशासनिक स्टाफ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। गियोवन्नी Provenzano Fondazione Veronesi (मिलान, इटली) से एक के बाद डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित है। इस काम इतालवी विश्वविद्यालय के मंत्रालय और रिसर्च (PRIN 2008 # अनुदान वाई बी को 200894SYW2_002 और PRIN 2010-2011 # अनुदान 2010N8PBAA_002), ट्रेंटो के विश्वविद्यालय (वाई बी को CIBIO स्टार्ट-अप अनुदान) और Telethon फाउंडेशन (करने के लिए अनुदान # GGP13034 द्वारा वित्त पोषित किया गया वाई बी)।
Materials
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
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