Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico
Summary
Descriviamo un protocollo immunoistochimica per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. Questo protocollo può essere applicato a entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.
Abstract
Induzione di fosforilata chinasi extracellulare regolate (pERK) è una lettura molecolare affidabile di apprendimento-dipendenti attivazione neuronale. Qui, descriviamo un protocollo immunoistochimica pERK per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. In particolare, abbiamo utilizzato immunostaining pERK studiare attivazione neuronale seguente Morris water maze (MWM, un compito di apprendimento classica ippocampo-dipendente) in engrailed-2 knockout (En2 – / -) topo, un modello di disturbi dello spettro autistico (ASD). Rispetto al wild-type (WT) controlli, En2 – / – topi hanno mostrato significativi deficit di apprendimento spaziale nel MWM. Dopo MWM, differenze significative nel numero di neuroni pERK-positivi sono stati rilevati in specifiche sottocampi dell'ippocampo di En2 – / – mice, rispetto agli animali WT. Così, il nostro protocollo può robustamente rilevare le differenze dineuroni pERK positivi associati alla compromissione apprendimento ippocampo-dipendente in un modello murino di ASD. Più in generale, il nostro protocollo può essere applicato per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo in entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.
Introduction
Disturbi dello sviluppo neurologico sono un gruppo di disturbi come la sindrome di Down, la sindrome X fragile (FXS), la sindrome di Rett, neurofibromatosi, sclerosi tuberosa e ASD, in cui lo sviluppo e la maturazione del sistema nervoso centrale (SNC) è disturbato nella fase iniziale un'ampia ed eterogenea il periodo prenatale 1. Queste disfunzioni dello sviluppo cerebrale possono causare profondi effetti per tutta la vita sulla funzione motoria, il linguaggio, l'apprendimento e il processo della memoria. Una pletora di fattori genetici e ambientali sono stati implicati nella patogenesi di disordini dello sviluppo neurologico negli ultimi anni 2,3. Anche se i meccanismi molecolari alla base del fenotipo clinico rimangono sconosciute, i risultati di cui sopra hanno permesso lo sviluppo di diversi modelli murini di questi disturbi. Apprendimento e memoria deficit sono stati identificati in un certo numero di questi modelli di topo, come Tsc1 +/-, TSC2 +/-,Nf1 +/- e En2 – / – mice 2,4-7. Una sfida importante nel campo dei disturbi del neurosviluppo è l'identificazione dei processi cellulari e molecolari alla base della memoria e dell'apprendimento erettile. Vie di segnalazione selezionati attivate durante l'apprendimento o la memoria possono indurre la trascrizione di geni specifici e alla fine porterà a de novo sintesi proteica. Geni immediati-precoce (IEGs) attivazione e proteine-dipendente modifiche sinaptiche stanno rapidamente indotte in neuroni del cervello in risposta all'attività neuronale e formazione comportamentale 8,9.
Deficit di vie di segnalazione che coinvolgono neurofibromin sono stati associati con l'apprendimento compromessa in disturbi dello sviluppo neurologico. Neurofibromin è il prodotto del gene NF1, cui mutazione provoca neurofibromatosi tipo 1, una sindrome genetica complessa caratterizzata da tumori del sistema nervoso, ritardi comportamentali e motorie e cognitive disabilità 10. Eterozigoti Mice per Nf1 cancellazione limitata ai neuroni inibitori mostrano deficit nella prima fase di potenziamento a lungo termine (LTP), così come l'apprendimento spaziale compromessa MWM 5,11,12. È interessante notare che la carenza Nf1 in questo modello di topo porta ad una attivazione eccessiva di segnalazione Ras in interneuroni inibitori durante l'apprendimento, con conseguente aumento della fosforilazione ERK ed infine in un miglioramento anormale di rilascio di GABA da questi neuroni 5.
Sulla base di questi risultati, la visualizzazione dell'attività neuronale dopo compiti comportamentali rappresenta un modo per ricostruire i circuiti specifici coinvolti in malattie dello sviluppo neurologico. Il protocollo immunoistochimica qui descritta ha lo scopo di valutare e quantificare dell'ippocampo livelli di fosforilazione ERK seguenti MWM in un modello di topo con ASD deficit cognitivi. MWM è ampiamente utilizzato per studiare dipendente apprendimento spaziale dell'ippocampo e la memoria nei roditori 13,14 </sup>. Decidiamo di utilizzare ERK fosforilazione come lettura molecolare di apprendimento ippocampo compito-dipendente, dal momento che ERK ha dimostrato di avere un ruolo essenziale nell'apprendimento e nella memoria la formazione 15. Inoltre, il percorso ERK è necessaria per la plasticità esperienza-dipendente in via di sviluppo corteccia visiva 16. Infine, topi privi di uno dei due isoforme (ERK ERK2) in mostra CNS contrassegnati anomalie nei comportamenti cognitivi, emotivi e sociali 17, che indica che la segnalazione ERK potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi di disturbi dello sviluppo neurologico, come ASD.
Abbiamo usato engrailed 2 knockout (En2 – / -) topo come modello di disturbi dello sviluppo neurologico. En2 – / – topi mostrano le caratteristiche anatomiche e comportamentali "ASD-like", tra cui la perdita di interneuroni prosencefalo 18, ridotta espressione di geni ASD-correlati 19, diminuzione socialità, e la flessibilità cognitiva 6,7,20. Learni spazialeng e difetti di memoria, come quelli rilevati in MWM, sono particolarmente robusti in En2 – / – mice 6,7 e potrebbero essere rilevanti per i deficit cognitivi osservati nei pazienti ASD 21. Inoltre, abbiamo dimostrato che alterata apprendimento spaziale in MWM è associata con l'espressione neurofibromin ridotti e aumento dei livelli di Perk nel ilo di En2 – / – topi adulti 7. Qui vi presentiamo il protocollo dettagliato per la caratterizzazione immunoistochimica di pERK seguito MWM in questo modello di topo ASD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, mettiamo a disposizione un protocollo immunoistochimica pERK per aver rivelato l'attivazione neuronale seguente MWM in En2 – / – mice, un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico. Livelli di pERK Diminuzione sono stati rilevati nel sottocampo CA3 di En2 – / – mutanti rispetto ai WT. A differenza di quanto osservato in CA3 sottocampo, un aumento generale dei neuroni pERK-positivi è stata invece rilevata sia ilo e GCL di En2 – / – mice rispetto al WT. Una possibile s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desideriamo ringraziare il personale amministrativo di CIBIO (Università di Trento) e CNR Neuroscience Institute per l'assistenza. Giovanni Provenzano è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato da Fondazione Veronesi (Milano, Italia). Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero italiano dell'Università e della Ricerca (PRIN 2008 grant # 200894SYW2_002 e PRIN 2010-2011 concessione # 2010N8PBAA_002 a YB), Università degli Studi di Trento (CIBIO concessione start-up a YB) e Fondazione Telethon (grant # GGP13034 a YB).
Materials
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O’Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
