신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화
Summary
우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하기 위해 면역 조직 화학 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은인지 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에 적용될 수있다.
Abstract
인산화 된 세포 외 조절 키나아제 (PERK)의 유도는 학습에 의존하는 신경 활성화의 안정적인 분자 판독입니다. 여기, 우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하는 특권 면역 프로토콜을 설명합니다. 마우스, 자폐증 스펙트럼 장애의 모델 (ASD) 특히, 우리는 모리스 물 미로 Engrailed-2 녹아웃에 (MWM, 고전 해마에 의존하는 학습 과제) (- – / EN2) 다음 신경 세포의 활성화를 연구하는 특권 면역 염색을 사용했다. 야생형 (WT) 대조군과 비교 된 바와 같이, EN2 - / – 마우스는 MWM 상당한 공간 학습 결핍을 보였다. WT 동물과 비교하여, 마우스 – / – MWM 후에 특권 양성 뉴런의 수에 큰 차이가 특정 해마 EN2의 서브 필드에서 검출된다. 따라서, 우리는 견고하게 프로토콜의 차이를 검출 할 수있다ASD의 마우스 모델에서 해마에 의존하는 학습 장애에 관련된 특권 양성 신경 세포. 보다 일반적으로, 우리는 프로토콜인지 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에서 해마의 신경 세포 활성의 프로파일을 조사하기 위해 적용될 수있다.
Introduction
신경 발달 장애와 같은 중추 신경계 (CNS)의 발달 및 성숙은 초기의 교란되는 다운 증후군, 깨지기 X 증후군 (FXS), 레트 증후군, 신경 섬유종증, 결절성 경화증 ASD 같은 장애의 다양한 이기종 기가 포함 산전 기간 1. 이러한 발달 뇌 기능 장애는 운동 기능, 언어, 학습과 기억 과정에 깊은, 평생 효과가 발생할 수 있습니다. 유전 적 및 환경 적 요인의 과다는 지난 몇 년 동안 2,3- 신경 발달 장애의 병인에 연루되어왔다. 임상 적 표현형을 기본 분자 메커니즘은 알려지지 남아 있더라도, 상술 한 결과는 이런 질환의 여러 마우스 모델의 개발을 허용했다. 학습 및 기억 결핍은 이러한 TSC1 +/- +/-, TSC2 이러한 마우스 모델에서 식별 번호되었습니다NF1 + 및 EN2 – / – 마우스 2,4-7. 신경 발달 장애의 분야에서 중요한 과제는 세포 및 분자 적 프로세스 메모리를 기본 및 학습의 기능 장애를 식별한다. 학습 또는 메모리 동안 활성화 선택한 신호 경로는 특정 유전자의 전사를 유도하고 궁극적으로 드 노보 단백질 합성으로 이어질 수 있습니다. 즉시 – 초기 유전자 (IEGs) 활성화 및 단백질에 의존하는 시냅스 수정은 빠르게 연결 활동 및 행동 훈련 8,9에 대한 응답으로 뇌의 신경 세포에서 유도된다.
neurofibromin을 포함하는 신호 전달 경로의 적자는 신경 발달 장애의 장애 학습과 관련이있다. Neurofibromin 누구의 변이 신경 섬유종증 제 1 형, 복잡한 유전 적 증후군은 신경계 종양, 행동 및 모터 지연,인지 DISA 특징으로 원인 NF1 유전자의 제품이다bilities 10. 억제 뉴런에 제한 NF1 삭제에 대한 마우스의 이형은 MWM 5,11,12의 장기 강화의 초기 단계 (LTP)뿐만 아니라 손상된 공간 학습 결손을 보여줍니다. 흥미롭게도,이 마우스 모델에서 NF1 결핍이 증가 ERK의 인산화에 마지막으로 이러한 뉴런 5에서 GABA 릴리스의 이상 향상의 결과로 학습하는 동안 억제의 interneurons에서 라스 신호의 오버 활성화로 연결됩니다.
이러한 발견에 기초하여, 행동 작업 후 신경 활성의 시각화는 신경 발달 질환에 관여하는 특정 회로를 재구성 할 수있는 방법을 나타낸다. 여기에 설명 된 면역 프로토콜은 평가하고인지 결핍과 ASD 마우스 모델을 MWM 다음 해마 ERK 인산화 수준을 정량화하는 것이다. MWM 널리 설치류 13, 14의 해마에 의존 공간 학습과 기억을 조사하는 데 사용됩니다 </s>까지. 우리는 ERK는 학습과 기억 형성 (15)에 필수적인 역할을하는 것으로 되었기 때문에, 작업에 의존하는 해마 학습의 분자 판독으로 ERK의 인산화를 사용하기로 결정. 또한, ERK 경로는 개발 시각 피질 (16)의 경험에 의존하는 소성 필요합니다. 마지막으로, CNS 쇼 두 ERK 이성체 (ERK2) 중 하나가 결여 된 마우스는 ERK 신호는 ASD 같은 신경 발달 장애의 발병 기전에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타내는,인지 감정적 사회적 행동 (17)에 이상을 표시했다.
신경 발달 장애의 모델로 마우스 (- – / EN2) 우리는 Engrailed 2 녹아웃을 사용했다. EN2 – / – 마우스는 전뇌의 interneurons (18)의 손실을 포함하여 해부학 적 및 행동 "ASD 같은"기능, ASD 관련 유전자 (19)의 감소 표현을 보여, 사교성을 감소하고, 장애인지 적 유연성 6,7,20. 공간 learniNG 및 MWM에서 검출 된 것과 같은 메모리 결함, EN2 특히 견고 – / – 마우스 6,7 및 ASD 환자 21에서 관찰 된인지 장애와 관련이 있습니다. – / – 성인 마우스 (7) 또한, 우리는 MWM에 손상 공간 학습이 감소 neurofibromin의 발현과 연관 EN2의 hilus의 특권 레벨을 증가 것으로 나타났다. 여기에서 우리는이 ASD 마우스 모델에서 MWM을 다음과 특권의 면역 조직 화학적 특성에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
– / – 마우스, 신경 발달 장애의 마우스 모델 여기서 우리는 신경 EN2에 MWM을 다음 활성화를 공개하기위한 특권 면역 조직 화학 프로토콜을 제공합니다. – / – 특권 레벨의 감소 EN2 CA3의 서브 필드에서 검출 된 돌연변이 WT에 비해. 다르게 CA3 서브 필드, 특권 양성 신경 세포의 일반적인 증가에서 관찰 된 것과 대신 모두 hilus에서 검출되었고, EN2의 GCL – / – 마우스 (WT)에 비해. ERK?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움을 CIBIO (트 렌토 대학)과 CNR 신경 과학 연구소의 행정 직원을 감사드립니다. 조반니 Provenzano는 Fondazione Veronesi (밀라노, 이탈리아)에서 박사 후 친교에 의해 지원됩니다. 이 작품은 이탈리아 대학의 연구부 (PRIN 2008 부여 # YB에 200894SYW2_002 및 PRIN 2,010에서 2,011 사이 부여 # 2010N8PBAA_002), 트 렌토 대학교 (YB에 CIBIO 스타트 업 허가) 및 텔레 톤 재단 (에 부여 # 1 GGP13034에 의해 투자되었다 YB).
Materials
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
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