A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Summary

Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

Abstract

Indução da quinase extracelular regulado fosforilada (pERK) é uma leitura molecular confiável de ativação neuronal dependente de aprendizagem. Aqui, descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica pERK estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Especificamente, nós usamos immunostaining pERK para estudar a ativação neuronal seguinte labirinto aquático de Morris (MWM, uma tarefa clássica de aprendizagem dependente do hipocampo) em Engrailed-2 nocaute (EN2 ^{– / -)} ratos, um modelo de transtornos do espectro do autismo (ASD). Em comparação com o tipo selvagem (WT) controles, EN2 ^{​​- / –} ratos mostraram déficits significativos de aprendizagem espacial na MWM. Após MWM, diferenças significativas no número de neurónios positivos pERK foram detectadas em subcampos do hipocampo específicas de EN2 ^{– / –} ratos, em comparação com animais WT. Assim, o nosso protocolo pode detectar diferenças de forma robustaneurônios pERK-positivos associados à deficiência de aprendizagem dependente do hipocampo em um modelo do rato da ASD. Mais geralmente, o nosso protocolo pode ser aplicado para estudar o perfil de activação neuronal no hipocampo em ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

Introduction

Desordens do neurodesenvolvimento incluem um grupo de doenças, tais como a síndrome de Down, síndrome X frágil (SXF), síndrome de Rett, neurofibromatose, esclerose tuberosa e ASD, no qual o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (SNC) é perturbado cedo durante largura e heterogénea o período pré-natal ^1. Essas disfunções cerebrais de desenvolvimento podem causar profundas, efeitos ao longo da vida em função motora, linguagem, aprendizagem e processo de memória. Uma pletora de factores genéticos e ambientais têm sido implicados na patogénese de desordens do neurodesenvolvimento durante os últimos anos ^2,3. Mesmo que os mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo clínico permanecem desconhecidos, os resultados acima mencionados têm permitido o desenvolvimento de vários modelos de ratinho destes distúrbios. De aprendizagem e défices de memória foram identificadas em vários destes modelos de murganho tais como TSC1 ^{+/-, +/-} TSC2,Nf1 ^+/- e EN2 ^{– / –} ratos ^2,4-7. Um desafio importante no domínio dos distúrbios do neurodesenvolvimento é a identificação de processos celulares e moleculares subjacentes aprendizagem e memória disfunção. Vias de sinalização activados seleccionados durante a aprendizagem ou a memória podem induzir a transcrição de genes específicos e, em última análise conduzir à síntese de novo da proteína. Genes imediatos-iniciais (IEGs) de activação e dependentes de proteína modificações sinápticas são rapidamente induzida nos neurônios do cérebro em resposta à atividade neuronal ea formação comportamental ^8,9.

Déficits em vias de sinalização que envolvem neurofibromin têm sido associados com a aprendizagem prejudicada em desordens do desenvolvimento neurológico. Neurofibromina é o produto do gene NF1, cuja mutação faz com neurofibromatose de tipo 1, uma síndrome genética complexa, caracterizada por tumores no sistema nervoso, atraso comportamentais e motoras, cognitivas e DISAbilidades ^10. Ratos heterozigotos para Nf1 eliminação restritas aos neurônios inibitórios mostrar déficits na fase inicial da potenciação de longa duração (LTP), bem como a aprendizagem espacial comprometida em MWM ^5,11,12. Curiosamente, a deficiência Nf1 neste modelo de ratinho leva a uma sobre-activação de sinalização de Ras na interneurónios inibitórios durante a aprendizagem, resultando no aumento da fosforilação de ERK e, finalmente, em uma ampliação anormal de libertação de GABA de neurónios destes ^cinco.

Com base nestes resultados, a visualização da actividade neuronal após tarefas comportamentais representa uma forma de reconstruir circuitos específicos envolvidos em doenças do neurodesenvolvimento. O protocolo de imuno-histoquímica descrito aqui tem o objetivo de avaliar e quantificar os níveis de fosforilação ERK hipocampo seguintes MWM em um modelo de rato ASD com déficits cognitivos. MWM é amplamente utilizado para investigar a aprendizagem espacial dependente do hipocampo e memória em roedores ^13,14 </sup>. Nós decidir usar ERK como leitura molecular de aprendizagem hipocampo-dependente tarefa, uma vez que ERK mostrou ter um papel essencial na aprendizagem e memória formação ^15. Além disso, a via ERK é necessário para dependente da experiência plasticidade no córtex visual desenvolvimento ^16. Finalmente, camundongos sem uma das duas isoformas (ERK ERK2) no show CNS marcado anomalias em comportamentos cognitivos, emocionais e sociais ^17, indicando que a sinalização ERK pode desempenhar um papel crítico na patogênese de desordens do desenvolvimento neurológico, tais como ASD.

Nós usamos Engrailed 2 nocaute (EN2 ^{– / -)} camundongos como modelo de desordens do desenvolvimento neurológico. EN2 ^{– / –} ratos mostram características anatômicas e comportamentais "ASD-like", incluindo a perda de ¹⁸ interneurons cérebro anterior, redução da expressão de genes relacionados com o ASD ^19, diminuição da sociabilidade e flexibilidade cognitiva prejudicada ^6,7,20. Learni espacialng e defeitos de memória, como os detectados na MWM, são especialmente robusta em EN2 ^{– / –} ratos e ^6,7 pode ser relevante para as deficiências cognitivas observadas em pacientes com TEA ^21. Além disso, mostramos que a aprendizagem espacial prejudicada em MWM está associada à redução da expressão neurofibromin e aumentou os níveis de pERK no hilo de EN2 ^{– / –} ratos adultos ^7. Aqui nós apresentamos o protocolo detalhado para a caracterização imuno-histoquímica de pERK seguinte MWM neste modelo de ratinho ASD.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a directiva comunitária 2010/63 / UE e foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano. 1. Cuidado Animal, Habitação e Tratamento Realizar todos os protocolos experimentais utilizando ratos de acordo com as diretrizes do respectivo cuidados com os animais institucional. Manter animais em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz com comida e água disponíveis ad libitum. Casa os ratos …

Representative Results

O protocolo aqui descrito foi concebido para visualizar, por imuno-histoquímica, a expressão de um marcador específico da actividade de neurónios do hipocampo após MWM num modelo de ratinho de desordens do neurodesenvolvimento. Todos os dados experimentais aqui apresentados foram obtidos a partir nossa recente trabalho 7. Foram utilizados obtidos a partir de cruzamentos heterozigotos; ninhada da mesma idade adultos (25-35 g de peso = 3-5 meses de idade) – Macho e fêmea WT e EN2 – /.</sup…

Discussion

Aqui, nós fornecemos um protocolo de imuno-histoquímica pERK para revelar a ativação neuronal seguinte MWM em EN2 ^{– / –} ratos, um modelo de rato de desordens do desenvolvimento neurológico. Diminuição dos níveis de pERK foram detectadas no subcampo CA3 do EN2 ^{– / –} mutantes em comparação com WT. Diferentemente do que observado no subcampo CA3, um aumento geral de neurônios pERK-positivos em vez foi detectado em ambos hilo e GCL de EN2 ^{– / –} ratos em comparação com WT. Uma po…

Materials

EthoVision XT 8	Noldus Information Technology		This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint	Giotto – Fila Group Company		White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome	Leica	VT1200	Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use.
Sodium Azide	Sigma	S2002
PBS	Sigma	P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal Goat Serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope	Zeiss	Axio Imager.M2	Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images.
Image J software	National Institute of Health		Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0	Systat Software Inc. (USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6	GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.