Vi beskriver en immunohistokemi protokoll för att studera profil hippocampus neuron aktivering efter exponering för en rumslig lärande uppgift i en musmodell som kännetecknas av kognitiva brister i nerv ursprung. Detta protokoll kan tillämpas på både genetiska eller farmakologiska musmodeller som kännetecknas av kognitiva brister.
Induktion av fosforylerad extracellulärt reglerad kinas (Perk) är en pålitlig molekyl avläsning av lärande beroende neuronal aktivering. Här beskriver vi en Perk immunohistokemi protokoll för att studera profilen hippocampus neuron aktivering efter exponering för en spatial inlärningsuppgift i en musmodell som kännetecknas av kognitiva brister av neuroursprung. Specifikt använde vi Perk immun att studera neuronal aktivering efter Morris vattenlabyrint (MWM, en klassisk hippocampus beroende inlärningsuppgift) i engrailed-2 knockout (EN2 – / -) möss, en modell av autismspektrumstörningar (ASD). Jämfört med vild-typ (WT) kontroller, EN2 - / – möss visade betydande rumsliga lärande underskott i MWM. Efter MWM, har betydande skillnader i antalet Perk-positiva neuroner upptäckts i specifika hippocampus delområden av EN2 – / – möss, jämfört med WT djur. Således kan våra protokoll robust upptäcka skillnader iPerk-positiva neuroner associerade till hippocampus beroende lärande försämring i en musmodell av ASD. Mer allmänt kan våra protokoll tillämpas för att undersöka profilen hippocampus neuron aktivering i både genetiska eller farmakologiska musmodeller som kännetecknas av kognitiva brister.
Nervsystemets sjukdomar inkluderar en bred och heterogen grupp av sjukdomar som Downs syndrom, Fragil X-syndromet (FXS), Retts syndrom, neurofibromatos, tuberös skleros och ASD, där utveckling och mognad av det centrala nervsystemet (CNS) störs tidigt under prenatal perioden 1. Dessa utvecklings hjärnan dysfunktioner kan orsaka djupgående, livslånga effekter på motorik, språk, inlärning och minne process. En uppsjö av genetiska och miljömässiga faktorer har varit inblandad i patogenesen av nervsystemets sjukdomar under de senaste åren 2,3. Även om de molekylära mekanismer som ligger bakom den kliniska fenotypen är fortfarande okända, har de ovan nämnda slutsatser möjliggjort utvecklingen av flera musmodeller av dessa sjukdomar. Lärande och minne underskott har identifierats i ett antal av dessa musmodeller som TSC1 +/-, TSC2 +/-,NF1 +/- och EN2 – / – möss 2,4-7. En viktig utmaning när det gäller nervsystemets sjukdomar är identifieringen av cellulära och molekylära processer som ligger bakom minne och inlärningsdysfunktion. Valda signaleringsvägar aktiveras under inlärning eller minne kan inducera transkription av specifika gener och i slutändan leda till de novo proteinsyntes. Omedelbara-tidiga gener (IEGS) aktivering och proteinberoende synaptiska ändringar snabbt induceras i hjärnans nervceller som svar på nervaktivitet och beteendeträning 8,9.
Brister i signalvägar som involverar neurofibromin har förknippats med försämrad inlärning i nervsystemets sjukdomar. Neurofibromin är produkten av NF1-genen, vars mutation orsakar neurofibromatos typ 1, en komplex genetisk syndrom som karakteriseras av nervsystemet tumörer, beteendemässiga och motoriska förseningar och kognitiv disaligheter 10. Möss heterozygot för NF1 radering begränsas till hämmande neuroner visar underskott i den tidiga fasen av långsiktig potentiering (LTP), samt nedsatt fysisk lärande i MWM 5,11,12. Intressant, NF1 brist i denna musmodell leder till en överaktivering av Ras-signalering i hämmande intern under inlärning, vilket resulterar i ökad ERK fosforylering och slutligen i en onormal ökning av GABA-frisättning från dessa neuroner 5.
Baserat på dessa upptäckter, visualisering av nervaktivitet efter beteende uppgifter utgör ett sätt att rekonstruera specifika kretsarna involverade i nervsystemets sjukdomar. Den immunohistokemi protokoll som beskrivs här är att bedöma och kvantifiera hippocampus ERK fosforylering nivåer efter MWM i en ASD musmodell med kognitiva brister. MWM används ofta för att undersöka hippocampus beroende spatial inlärning och minne hos gnagare 13,14 </supp>. Vi väljer att använda ERK fosforylering som molekyl avläsning av uppgiften beroende hippocampus lärande, eftersom ERK visade sig ha en viktig roll när det gäller inlärning och minnesbildning 15. Dessutom är nödvändigt för erfarenhet beroende plasticitet i utvecklings syncentrum 16 ERK-vägen. Slutligen, möss som saknar en av de två ERK isoformer (ERK2) i CNS showen markerade avvikelser i kognitiva, emotionella och sociala beteenden 17, vilket tyder på att ERK signalering kan spela en avgörande roll i patogenesen för nervsystemets sjukdomar såsom ASD.
Vi använde engrailed 2 knockout (EN2 – / -) möss som en modell för nervsystemets sjukdomar. En2 – / – möss visar anatomiska och beteende "ASD-liknande" funktioner, bland annat förlust av framhjärnan interneuronen 18, minskat uttryck av ASD-relaterade gener 19, minskade sällskaplighet och nedsatt kognitiv flexibilitet 6,7,20. Rumslig learning och minnesdefekter, såsom de som upptäcktes i MWM, är särskilt stark i EN2 – / – möss 6,7 och kan vara relevanta för den kognitiva funktionsnedsättningar som observerats i ASD patienter 21. Dessutom visade vi att nedsatt fysisk lärande i MWM är förknippad med minskad neurofibromin uttryck och ökad Perk nivåer i hilus av EN2 – / – vuxna möss 7. Här presenterar vi detaljerade protokoll för immunhistokemisk karakterisering av Perk efter MWM i ASD musmodell.
Här ger vi en Perk immunohistokemi protokoll för att avslöja neuronal aktivering efter MWM i EN2 – / – möss, en musmodell av nervsystemets sjukdomar. Minskade nivåer av Perk detekterades i CA3-underfältet av EN2 – / – mutanter jämfört med WT. Till skillnad från vad som observerats i CA3 delfält beräknas en generell höjning av Perk-positiva neuroner istället detekteras i både hilus och GCL av EN2 – / – möss jämfört med WT. En möjlig förklaring till denna motsatt trend i…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka den administrativa personalen på CIBIO (University of Trento) och CNR neurovetenskap Institutet för hjälp. Giovanni Provenzano stöds av en post-doc stipendium från Fondazione Veronesi (Milano, Italien). Detta arbete har finansierats av det italienska ministeriet för universitet och forskning (PRIN 2008 bidrag # 200894SYW2_002 och PRIN 2010-2011 bidrags # 2010N8PBAA_002 till YB), University of Trento (CIBIO startbidrag till YB) och Telethon Foundation (bidrags # GGP13034 till YB).
EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
ddH2O | |||
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |