An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Glicopolímeros sintéticos são ferramentas instrumentais e versáteis utilizados em vários campos de pesquisa bioquímicos e biomédicos. Um exemplo de uma síntese fácil e eficiente de glicopolímeros estatísticos fluorescentes bem controlados usando reversível adição-fragmentação de transferência de cadeia (RAFT) polimerização baseados é demonstrada. A síntese inicia-se com a preparação de 2-metacrilamida glycomonomer lactobionamidoethyl contendo β-galactose obtido por reacção de lactobionolactone e N – (2-aminoetil) metacrilamida (AEMA). 2-Gluconamidoethyl metacrilamida (GAEMA) é usado como um análogo estrutural falta um β-galactósido terminal. A seguinte reacção de copolimerização mediada por RAFT envolve três monómeros diferentes: N – (2-hidroxietil) acrilamida como espaçador, AEMA como alvo para posterior marcação por fluorescência, e os glycomonomers. Tolerante de sistemas aquosos, o agente RAFT usado na reacção é (ácido 4-cianopentanóico) -4-dithiobenzoate.Low dispersities (≤1.32), composições de copolímeros previsíveis e alta reprodutibilidade das polimerizações foram observadas entre os produtos. Polímeros fluorescentes são obtidas através da modificação das glicopolímeros carboxifluoresceína com éster de succinimidilo alvejando os grupos funcionais de amina primária em AEMA. Especificidades de ligação de lectina das glicopolímeros resultantes são verificados por meio de testes com esferas de agarose correspondentes revestidos com glycoepitope reconhecendo lectinas específicas. Devido à facilidade de síntese, o apertado controlo das composições e produtos da boa reprodutibilidade da reacção, este protocolo pode ser traduzido no sentido preparação de outros glicopolímeros à base de balsa com estruturas e composições específicos, se o desejar.
Nas últimas duas décadas, as investigações com glicopolímeros sintéticos tenham sido submetidos a um desenvolvimento lento, mas contínuo, demonstrando potencial significativo no exame infecciosas mecanismos que incluam actividades de investigação que incide sobre lectina reconhecimento processa 1-3. Desde glicopolímeros sintéticos possuindo porções de açúcar multivalentes exibem eficácias de ligação a lectina muito mais elevadas, em comparação com os hidratos de carbono monovalentes, eles são de grande procura no campo Glycobiology 3. De particular interesse na investigação clínica é a utilização de glicopolímeros fluorescentes para caracterizar a ligação com hidratos de carbono disponíveis na superfície das células do aparelho respiratório humano e glicoproteína mucosa bacteriana mediada por lectinas. No início de estudos in vitro empregues glicopolímeros baseados em poliacrilamida disponíveis comercialmente em testes de ligação bacterianas. Várias dessas sondas mostraram resultados promissores, mas levantou preocupações a respeito, variâncias obtainability, e de lote para lote, tanto polpeso molecular Ymer e conteúdo glycoepitope. Um protocolo econômico em laboratório foi desenvolvido o que proporcionaria para um controle satisfatório de conteúdo estrutura, tamanho e pureza de glicopolímeros sintéticos visando lectinas bacterianas.
Em busca de uma abordagem sintética adequada para glicopolímeros, uma técnica relativamente nova de polimerização foi testada usando um tipo de polimerização radical controlada que empregue reversível adição-fragmentação da cadeia de transferência (RAFT) agentes 4. Tais reagentes RAFT foram recentemente utilizados em algumas preparações glicopoliméricos 5-7. Em comparação com outros protocolos de preparação glicopoliméricos, polimerizações mediada por RAFT demonstrar várias vantagens, incluindo a tolerância a uma variedade de estruturas de monómeros e as condições de reacção, a compatibilidade potencial com soluções aquosas, e baixa dispersividade de tamanhos dos produtos poliméricos desejados 8,9. De notável interesse são protocolos para a preparação de JANGADA-baglicopolímeros tri-componente sed, permitindo o controlo de composições de monómeros diferentes, cada um dos quais podem ter funções distintas 10-13. No entanto, a maioria dos esforços de pesquisas anteriores ou faltava anom�icos carboidratos pingente 10, ou empregada entrou polimerização, resultando em copolímeros tri-bloco, que consistem em homopolimeros covalente, que muitas vezes servem a propósitos diferentes do que os polímeros estatísticos que são copolímeros em que a sequência de monômero resíduos de seguir uma regra estatística 9-13.
Recentemente, empregando o composto RAFT thiocarbonylthio (ácido 4-cianopentanóico) -4-dithiobenzoate num ambiente aquoso, a preparação de um grupo de TRAF baseado no glicopolímeros estatísticos tri-componente lineares contendo pendentes açúcares específicos e a sua aplicação em ligação bacteriana mediada por lectina testes foi relatado 14. O objetivo geral deste método, apresentadas de forma visual, é preparar tri-componenteglicopolímeros fluorescentes estatísticos por copolimerização controlado-jangada. Devido à facilidade de o protocolo de polimerização de uma etapa, o controlo fino sobre o comprimento de polímeros e composições, e a elevada reprodutibilidade da reacção, este protocolo pode ser facilmente aplicado para outras sínteses à base de conjunto de glicopolímeros com estruturas desejadas.
Um protocolo fácil e eficiente para glicopolímeros fluorescentes baseados em RAFT tri-componente, com e sem um hidrato de carbono pendente, e a sua utilização num teste de ligação a lectina, é demonstrado no presente relatório. O protocolo começa com a preparação de glycomonomers LAEMA e GAEMA. Através de um controlo-RAFT copolimerização de um só passo, com rendimento glicopolímeros reprodutível, composição de monómero previsível e baixa dispersividade, são obtidos. Seguindo pós-modificação de glicopolímeros com éster de succinimidilo de carboxifluoresceína, a ligação do respectivo glicopoliméricos marcado com fluorescência resultante é facilmente verificável para a sua especificidade de ligação a lectina.
Nos passos preparativos iniciais dos glycomonomers que são para ser empregues nas sínteses glicopoliméricos subsequentes, foram utilizados ácido lactobiónico prontamente disponível e a gluconolactona. Em teoria, quaisquer hidratos de carbono de interesse a partir de monossacáridos, oligossacáridos complexos para, pode ser Converted para glycomonomers por conjugação do açúcar alvo para o grupo hidroxilo primário em C6 de glucose. Após a oxidação do resíduo de glucose redutores, e a sua desidratação subsequente a uma lactona, o produto pode então ser facilmente feito reagir com a amina primária em AEMA para formar o correspondente glycomonomer. Outros exemplos desta via pode ser visto em um relatório recente 14. Deve notar-se que antes de iniciar qualquer passo de polimerização, de MEHQ, um potente inibidor de polimerização, deve ser removido a partir de todas as preparações de monómeros e glycomonomer imediatamente antes da utilização. Isto é facilmente conseguido através da utilização da quantidade mínima de metanol para dissolver o glycomonomer que possui MEHQ seguida tratá-la imediatamente com acetona à temperatura de -20 ° C para precipitar o produto isento de inibidor, com elevado rendimento.
Essencial em qualquer esquema de polimerização radical, atenção aos detalhes e de monômero purezas são enfatizados. Como é típico de um sistema de polimerização RAFT, que consiste deuma fonte de radicais, um reagente RAFT, um monómero e solvente. Nesta apresentação visualizada, um sistema de polimerização TRAF de um só passo é descrito que incide sobre a produção de copolímeros estatísticos gerados a partir de uma mistura de reacção que possua três monómeros diferentes em uma solução aquosa. Duas reacções mediadas por RAFT separadas são apresentados no qual se utiliza um glycomonomer que possui um pendente, não redutor do hidrato de carbono terminal (isto é, β-D-galactose), e o outro, possuindo um poliol, sem resíduo de hidrato de carbono ligado. Comum a ambas as reacções mediadas por RAFT foram monómeros que possuem um grupo hidroxilo singular que serve como uma molécula separadora, e uma outra que possua uma amina livre de pós-modificação com um fluoróforo amino-reactivo.
Uma vez que a presença de oxigénio na mistura de reacção e do ambiente é prejudicial para a polimerização TRAF-mediada, a sua remoção para níveis vestigiais é prontamente conseguida através de vários congelamento-evaciclos cuate-descongelação, mantendo o recipiente de reacção de tubo de Schlenk sob alto vácuo.
Deve notar-se que a razão molar de diferentes monómeros na reacção pode ser ajustada conforme necessário. Além disso, fazendo variar a quantidade de agente RAFT usado, o comprimento dos polímeros resultantes pode ser controlada 18. No entanto, a proporção molar do agente de TRAF para iniciador deve ser sempre superior a dois para assegurar a baixa dispersibilidade do produto. Sob estas condições, a evolução da copolimerização é constante, e a reprodutibilidade da reacção é muito alta. Dito isto, é pouco provável que se obtém uma distribuição totalmente uniforme de todos os monómeros participantes dentro de um copolímero estatístico, devido às suas velocidades de polimerização diferentes. Caracterizar a distribuição de diferentes monómeros dentro do polímero ainda é muito difícil.
O método de pós-modificação, aqui apresentado, é ao mesmo tempo mais simples e mais amenable para a utilização de uma vasta selecção de marcadores fluorescentes, em comparação com outros protocolos aplicados para glicopolímeros etiqueta 2,11. Estes incluem muitos dos fluoróforos reactivos com aminas solúveis em água, quantum dots, biotinas, e outros. As especificidades de ligação dos sintetizados, glicopolímeros marcadas são prontamente verificáveis utilizando lectinas com afinidades de ligação conhecidas. PMA-GAEMA possuir nenhum açúcar pingente é um controle negativo apropriado. Glicopolímeros com diferentes etiquetas fluorescentes preparados por esta via tem sido utilizada com sucesso em investigações de lectina bacteriana mediada por ligação 14. Como apresentado, esta preparação fácil e eficiente de glicopolímeros fluorescentes estatísticos deve fornecer um grande potencial para uma ampla variedade de pesquisa glycobiological.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Reagent | |||
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
Solvent | |||
dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
Equipment | |||
Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
Lyophilizer | Labconco | ||
Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
Vacuum Gauge | Sargent-Welch |