डिजिटल न्यूक्लिक एसिड की मात्रा assays के सरल थोक पढ़ा गया
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
डिजिटल assays के दुर्लभ कोशिकाओं और व्यक्तिगत न्यूक्लिक एसिड अणुओं की गिनती का पता लगाने के लिए सक्षम है कि शक्तिशाली तरीके हैं। हालांकि, डिजिटल assays के नियमित रूप से की वजह से लागत और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरीकों के साथ जुड़े विशिष्ट उपकरणों के लिए, लागू नहीं भी कर रहे हैं। यहाँ हम छोटी बूंद-आधारित डिजिटल assays के थोक प्रतिदीप्ति को मापने के लिए एक पारंपरिक वास्तविक समय पीसीआर साधन का उपयोग कर डिजिटल छोटी बूंद assays के readout के लिए एक सरल तरीका मौजूद है।
हम सिंथेटिक छोटी बूंद मिश्रण और एक छोटी बूंद डिजिटल कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) परख का उपयोग थोक readout परख के प्रदर्शन की विशेषताएँ। एक डिजिटल प्रतिक्रिया स्वरूप से मात्रात्मक एमडीए विशेष रूप से लाभ, लेकिन हमारी नई विधि किसी भी डिजिटल परख करने के लिए लागू होता है। इस तरह के डिजिटल पीसीआर के रूप में स्थापित डिजिटल परख प्रोटोकॉल के लिए, इस विधि की गति को और परख readout के सरल करने के लिए कार्य करता है।
हमारी थोक readout कार्यप्रणाली partitione का लाभ लाता हैविशेष readout के उपकरण के लिए आवश्यकता के बिना घ assays। इस मानक के लिए आवश्यकताओं को एक पारंपरिक वास्तविक समय प्रयोग के लिए की तुलना में कम मांग कर रहे हैं, हालांकि थोक readout के कार्यप्रणाली की प्रिंसिपल सीमाओं, छोटी बूंद गिनती प्लेटफार्मों और एक मानक नमूना के लिए जरूरत के साथ तुलना में गतिशील रेंज कम कर रहे हैं। मात्रात्मक पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) WGA प्रतिक्रियाओं में contaminants के लिए परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है और दवा गुणवत्ता नियंत्रण और astrobiology सहित विभिन्न आवेदन क्षेत्रों में विधि महान वादा देने अज्ञात दृश्यों के साथ डीएनए टुकड़े की उपस्थिति का पता लगाने के लिए सबसे संवेदनशील तरीका है, है।
Introduction
न्यूक्लिक एसिड की मात्रा का ठहराव (डिजिटल पीसीआर) 1-4 और आधार आदेश (अनुक्रमण) के लिए डिजिटल assays दृढ़ता से जीवन विज्ञान और चिकित्सा प्रभावित कर रहे हैं। डिजिटल assays, उच्च संवेदनशीलता को उपलब्ध कराने के प्रयोगों भर में सतही तुलना की, सक्रिय करने और महत्वपूर्ण, तुलनीय डेटा 5 (1 टेबल) से युक्त बड़े डेटाबेस के निर्माण को सक्षम करने, एक पूर्ण पैमाने (एक नियंत्रण के सापेक्ष नहीं) पर आणविक गिनती की मात्रा का ठहराव प्रदान करते हैं।
पिछले 15 वर्षों में, पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन के लिए एक सामान्य उपकरण के रूप में पीसीआर के साथ उभरा। पीसीआर की तरह, WGA आसानी से पता लगाया या आधार अनुक्रमण तरह बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक स्तर तक मिनट नमूना तत्वों amplifying द्वारा विश्लेषणात्मक और प्रारंभिक अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है। पीसीआर के विपरीत, WGA बल्कि अज्ञात दृश्यों सहित नमूने में सभी दृश्यों का प्रवर्धन की अनुमति, एक विशेष डीएनए ठिकाना लिए विशिष्ट नहीं है।पीसीआर और WGA के बीच यह बुनियादी फर्क एक दूसरे के पूरक के तरीकों में आता है और अपने आवेदन में विभिन्न चुनौतियों को जन्म देता है।
WGA प्रतिक्रियाओं 6 की उच्च उपज एकल अणुओं 7, एकल कक्षों 8 और मात्रा का ठहराव या आगे के विश्लेषण के लिए अन्य कम बायोमास नमूने 9 से जीनोमिक डीएनए की दिनचर्या प्रवर्धन सक्षम बनाता है। WGA रसायन विज्ञान के साथ जुड़े प्रमुख चुनौतियों अपनी contaminants के लिए अत्यधिक संवेदनशीलता और व्यक्तिगत टेम्पलेट अणुओं 6 भर में असमान प्रवर्धन हैं। एकल कोशिका अनुक्रमण के रूप में हालांकि, WGA लोकप्रिय हो रहा है WGA द्वारा WGA प्रौद्योगिकी 10, और टेम्पलेट मात्रा का ठहराव का 'हत्यारा आवेदन "के रूप में उभरा है आवेदन 7 के कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है।
डिजिटल न्यूक्लिक एसिड की मात्रा का ठहराव के लिए इंस्ट्रुमेंटेशन पहले Valved और बिना वाल्व का microfluidic प्रपत्र की एक किस्म में वर्णित किया गया हैछोटी बूंद आधारित assays सहित टीएस 11-14, 15,16 (तालिका 2)। हालांकि, डिजिटल विश्लेषण के लिए वाणिज्यिक सिस्टम microfluidic प्रतिक्रिया सेटअप और उत्पाद का पता लगाने के लिए 17 विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। कस्टम valved microfluidics लचीला कर रहे हैं, लेकिन सटीक microfabrication और साँस का नियंत्रण प्रणालियों 18 की आवश्यकता होती है। यह पायस आधारित डिजिटल assays के 19,20 के लिए monodisperse सूक्ष्म बूंदों बनाने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, जबकि डिजिटल readout बड़े पैमाने पर व्यापक क्षेत्र इमेजिंग या तो आवश्यकता होती है, (लोकप्रिय अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के समान) तकनीकी रूप से भारी है 21,22 या उच्च गति छोटी बूंद का पता लगाने के 23-25 प्रवाह आधारित। आदर्श रूप में, एक डिजिटल परख जटिल उपकरण के लिए कम करने की जरूरत है और जल्दी से बाहर पढ़ने के लिए हो नमूनों की बड़ी संख्या के लिए अनुमति देता है, readout के लिए सेट-अप से आसान हो जाएगा। यहाँ हम पीसीआर मैं एक पारंपरिक वास्तविक समय का उपयोग करता है कि डिजिटल छोटी बूंद assays के readout के लिए एक सरल विधि का वर्णनnstrument छोटी बूंद-आधारित डिजिटल assays के थोक प्रतिदीप्ति मापने के लिए।
नया दृष्टिकोण डिजिटल पीसीआर assays के लिए लागू किया जा सकता है, यह (पीसीआर के लिए उत्कृष्ट परिणाम दे) समस्याग्रस्त हैं वास्तविक समय प्रवर्धन assays के अनुरूप है जिसके लिए डिजिटल WGA assays के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है। WGA सामान्यतः अनुक्रम, लंबाई, और आधार सामग्री में विषम हैं कि टेम्पलेट के अणुओं के साथ नमूने के लिए लागू किया जाता है। ये अलग टेम्पलेट अणुओं एक संदर्भ ("मानक") मिलान विशेषताओं के साथ नमूना के उपयोग की जरूरत महसूस, अलग-अलग दरों 6 पर परिलक्षित कर रहे हैं। अक्सर, ऐसी कोई मानक उपलब्ध है, या भेजे गए नमूनों की विशेषताओं से अनजान हैं। इनपुट जन, अणुओं के इनपुट संख्या, दो, या न करने का एक संयोजन – WGA chemistries के इनपुट सामग्री और लंबाई पर निर्भर संपत्ति की विविधता 26 भी मात्रा निर्धारित किया जा रहा है क्या में अस्पष्टता बनाने के द्वारा परिणामों की व्याख्या मुश्किल। एफकिसी भी क्रम से दूषित पदार्थों के अणुओं हस्तक्षेप करने के लिए एक संभावित है के बाद से inally, अनुक्रम-गैर विशिष्टता मात्रात्मक पीसीआर से संदूषण के लिए मात्रात्मक कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) और अधिक संवेदनशील बना देता है। Microfluidic डिजिटल assays टेम्पलेट अणुओं को अलग और कम दूषित पदार्थों को जांचा जाता है कि इस तरह की प्रतिक्रिया की मात्रा को कम करने से प्रदूषण को संबोधित करते हैं।
यहाँ हम एक लोकप्रिय इज़ोटेर्माल WGA विधि, एमडीए 27 का उपयोग करें। ध्यान से, PicoPlex और MALBAC 28 सहित कई अन्य WGA chemistries प्रारंभिक इज़ोटेर्माल कतरा विस्थापन कदम पर महत्वपूर्ण निर्भर करते हैं। इज़ोटेर्माल कदम मात्रात्मक WGA के लिए अनुरूप वास्तविक समय assays के आवेदन करने की चुनौती बढ़ा। WGA न तो पूरी तरह, सेटअप के दौरान रोका अवांछित चर पूर्व प्रवर्धन के लिए अग्रणी है और न ही विषम अणुओं की प्रतिकृति पूरा करने के लिए प्रेरित किया है और रोका जा सकता है, जहां एक तरह से ("साइकिल") discretized किया जा सकता पीसीआर 11 की तरह अगले चक्र के लिए पूर्व </sup> (चित्रा 1)। WGA के लिए एक डिजिटल परख प्रारूप की वजह से परख समापन बिंदु पर गणना के लिए प्रत्येक अणु के अलगाव के लिए ठेठ प्रतिक्रिया सेटअप प्रक्रियाओं accomodates मूल readout सटीकता प्रवर्धन दक्षता में विभिन्नता का काफी हद तक स्वतंत्र होगा इसका मतलब है (ताकि पूर्व प्रवर्धन परिणामों को प्रभावित नहीं करता है)।
परख समापन बिंदु पर छोटी बूंद प्रति संकेत स्तर छोटी बूंद की मात्रा पर निर्भर करेगा के रूप में परख, वर्दी संस्करणों के साथ तेल में उत्पादित बूंदों पर निर्भर करता है, और हम परिणामों की स्थिरता छोटी बूंद आकार के एक वितरण भर में औसत पर निर्भर नहीं करना चाहते हैं। Monodisperse बूंदों बनाना अब (लगभग 3,500 monodisperse छोटी बूंद कागजात 2013 के बाद से प्रकाशित किया गया है) एक मानक प्रक्रिया है, लेकिन microfluidic इंस्ट्रूमेंटेशन 25 की आवश्यकता है। वास्तव में, अधिक से अधिक छह कंपनियों ने इस तरह की बूंदों के उत्पादन पर निर्भर है कि स्वतंत्र वाणिज्यिक उत्पादों का विकास किया है, और छोटी बूंद-बनाने microfluidic चिप्स हैं23,29 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध। इस अध्ययन के लिए, हम घर में (प्रोटोकॉल देखें) उत्पादित कस्टम microfluidic उपकरणों का इस्तेमाल किया। सिरिंज उपकरणों के माध्यम से प्रवाह भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ड्राइव करने के लिए पंप, लेकिन वैकल्पिक रूप से, लागत 30 कम करने के लिए वैक्यूम संचालित प्रवाह के लिए एक एकल डिस्पोजेबल सिरिंज के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डिजिटल assays के दुर्लभ कोशिकाओं का पता लगाने और न्यूक्लिक एसिड अणुओं के व्यक्ति की गिनती सक्षम है कि शक्तिशाली तरीके हैं। हालांकि, डिजिटल assays अभी भी नियमित रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरीकों के साथ जु?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
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