Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Dijital deneyler hücrelerin nadiren ve tek tek nükleik asit moleküllerinin sayımı saptanmasını sağlayan güçlü yöntemlerdir. Ancak, dijital tahliller rutin nedeniyle maliyet ve piyasada mevcut yöntemlerle ilgili özel ekipman, uygulanan değil hala. Burada damlacık tabanlı dijital tahliller kütle floresan ölçmek için geleneksel bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak dijital damlacık deneylerinin okunması için basit bir yöntem sunulmaktadır.
Biz sentetik damlacık karışımları ve damlacık dijital çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) testi kullanılarak toplu okuma testinin performansını karakterize. Dijital reaksiyon biçimi Kantitatif MDA özellikle faydaları, ama bizim yeni bir yöntem herhangi bir dijital tahlil için de geçerlidir. Dijital PCR gibi kurulan dijital deney protokolleri için, bu yöntem, hızlandırmak ve deney okuma kolaylaştırmak için hizmet eder.
Bizim toplu okuma metodolojisi partitione avantajlarını getiriyorözel okuma enstrümantasyon gerek kalmadan d tahliller. Bu standart için gereksinimler geleneksel gerçek zamanlı deney için daha az talepkar olmasına rağmen toplu okuma metodolojisi temel sınırlamalar, damlacık sayma platformları ve standart bir numune için ihtiyacı ile karşılaştırıldığında dinamik aralık azalır. Kantitatif tüm genom amplifikasyonu (WGA) WGA reaksiyonlarda kirletici maddeler için test etmek için kullanılır ve farmasötik kalite kontrol ve astrobiyolojiden dahil olmak üzere çeşitli uygulama alanlarında yöntemi büyük umut veren bilinmeyen dizilerle DNA parçalarının varlığını tespit etmek için, en hassas bir şekilde işleme tabi tutulur.
Introduction
Nükleik asit ölçümü (dijital PCR) 1-4 ve taban sırası (sıralama) için dijital analizler şiddetle yaşam bilimleri ve tıp etkilemektedir. Dijital deneyleri, yüksek hassasiyet sağlayan deneyler üzerinde yüzeysel karşılaştırmalar sağlayarak ve en önemlisi, karşılaştırılabilir veriler 5 (Tablo 1) içeren büyük veritabanları yapımını sağlayan mutlak ölçek (bir kontrole göre değil) moleküler sayımı ölçümü sağlar.
Son 15 yılda, tüm genom amplifikasyonu (WGA) nükleik asit amplifikasyonu için genel bir araç olarak PCR ile birlikte ortaya çıktı. PCR gibi, WGA kolayca tespit veya baz sıralama gibi daha sonraki analizler için kullanılabilecek bir seviyeye kadar dakikalık numune elemanlarını yükselterek analitik ve preparatif uygulamalar için kullanışlıdır. PCR aksine, WGA tercih bilinmiyor sekanslar dahil olmak üzere numunedeki tüm sekanslar, amplifikasyon sağlayan belirli bir DNA lokusu için özel değildir.PCR ve WGA arasındaki bu temel fark birbirine tamamlayıcı yöntemler yapar ve bunların uygulamada farklı zorluklar doğurur.
WGA reaksiyonlar 6 yüksek verimi tek moleküllerin 7, tek hücreler 8 ve miktar tayini ya da daha fazla analiz için diğer düşük biyokütle örnekleri 9 genomik DNA rutin amplifikasyonunu sağlamaktadır. WGA kimya ile ilgili önemli zorluklar onun kirlere karşı aşırı hassasiyet ve bireysel şablon molekülleri 6 genelinde dengesiz amplifikasyon vardır. Tek hücreli sıralama Ancak, WGA kazanıyor popülerlik WGA tarafından WGA teknolojisi 10, ve şablon nicelikleme "katil uygulaması" olarak ortaya çıkmıştır uygulamanın 7 birçok alanda önemlidir.
Dijital nükleik asit ölçümü için Alet, daha önce Valfli ve supapsız mikroakışkan forma çeşitli tarif edilmiştirdamlacık bazlı deneyler dahil olmak üzere, ts 11-14, 15,16 (Tablo 2). Ancak, dijital analiz için ticari mikroakışkan sistemler reaksiyon kurulumu ve ürün tespiti 17 için özel ekipman gerektirir. Özel valfli Mikroakiskan esnek, ama hassas mikroüretim ve pnömatik kontrol sistemleri 18 gerektirir. Bu emülsiyon tabanlı dijital deneyleri 19,20 için monodispers mikro damlacıklar yapmak nispeten basit olmakla birlikte, dijital okuma büyük ölçekli geniş alan görüntüleme ya gerektiren, (popüler yeni nesil dizileme teknolojileri benzeri) teknik külfetli olduğu 21,22 veya Yüksek hızlı damlacık algılama 23-25 akış tabanlı. İdeal olarak, bir dijital deney karmaşık enstrümantasyon ihtiyacını azaltarak ve hızlı bir şekilde dışarı okunacak örneklerin çok sayıda izin okunmasını set-up basit olurdu. Burada PCR i konvansiyonel gerçek zamanlı kullanan dijital damlacık deneyleri okuma için basitleştirilmiş bir yöntem tarifişle- mini yaparken damlacık tabanlı dijital testlerin toplu floresan ölçmek için.
Yeni yaklaşım, dijital PCR uygulanabilir olsa da, (PCR için mükemmel sonuç verir) sorunlu gerçek zamanlı amplifikasyon deneylerini analog olan bir dijital WGA deneyleri için özellikle avantajlıdır. WGA yaygın sekansı, uzunluğu, ve baz içeriği heterojendir şablon molekülleri ile örneklere uygulanır. Bu farklı şablon molekülleri referans ("standart") eşleşen özelliklere sahip numunenin kullanımını gerektiren, farklı oranlarda 6 güçlendirilir. Genellikle, böyle bir standart mevcuttur ya da gelen örneklerin özellikleri bilinmemektedir. Giriş kütlesi, moleküllerin giriş numarasını, iki ya da ne bir arada – WGA kimyaları giriş malzeme ve uzunluğu bağımlı mülkiyet heterojenliği 26 de sayısal ediliyor ne de belirsizlik yaratarak sonuçların yorumlanmasını zorlaştırmaktadır. FHerhangi bir dizinin kirletici molekülleri müdahale için potansiyele sahip çünkü inally, dizi-dışı özgüllük kantitatif PCR daha kirlenmeye kantitatif çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) daha duyarlı hale getirmektedir. Mikroakışkan dijital tahliller şablon molekülleri ayırma ve daha az kirletici örneklenmiş öyle ki tepkime hacimleri azaltarak kirlenmesini hitap etmektedir.
Burada popüler bir izotermal WGA yöntemi, MDA 27 kullanın. Unutmayın ki, PicoPlex ve MALBAC 28 dahil olmak üzere birçok diğer WGA kimyaları ilk izotermal sarmal yer değiştirme merdivenlerinde önemlisi bağlıdır. Izotermal adımlar nicel WGA analog gerçek zamanlı deneyleri uygulanarak meydan alevlenmesine. WGA ne tamamen kurulum sırasında engelledi istenmeyen değişken ön büyütme giden, ne heterojen moleküllerin çoğaltma tamamlanmasına tahrik ve durdurulabilir bir şekilde ("sağlanıncaya") discretized edilebilir PCR 11 gibi sonraki döngüsü önce </sup> (Şekil 1). WGA için dijital tahlil biçimi nedeniyle tahlil uç noktada sayımı için her molekülün ayrılığı tipik reaksiyon kurulum işlemlerini barındıran özgün okuma doğruluğu amplifikasyon verimliliği varyasyon büyük ölçüde bağımsız olacağını ifade (yani preamplıfikasyon sonuçlarını etkilemez).
Tahlil uç noktada damlacık başına sinyal seviyesi damlacık hacmine bağlıdır olarak tahlil, üniforma hacimli yağ üretilen damlacıklar bağlıdır ve biz sonuçların tutarlılığı damlacık boyutları dağılımı boyunca ortalama bağlıdır istemiyorum. Monodispers damlacıkları yapma şimdi (yaklaşık 3.500 monodispers damlacık kağıtları 2013 yılından bu yana yayınlanmış) standart bir prosedür olduğunu, ancak mikroakışkan enstrümantasyon 25 gerektirir. Aslında, fazla altı şirketlerin bu tür damlacıkların üretimine dayanan bağımsız ticari ürünler geliştirdik ve damlacık yapma mikroakışkan cips23,29 ticari olarak temin edilebilir. Bu çalışma için, in-house (Protokol bakınız) üretilen özel mikroakışkan cihazları kullanılır. Şırınga cihazlar yoluyla akışı da ticari olarak temin edilebilir sürücü pompalar, fakat alternatif olarak, maliyetleri azaltmak için 30 vakum bağlı akış için tek tek kullanımlık şırınga ile sübstitüe edilmiş olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dijital deneyler, nadir görülen hücrelerin tespit ve nükleik asit moleküllerinin bireyin sayımı sağlayan güçlü bir yöntem vardır. Bununla birlikte, dijital deneyler de rutin olarak ticari olarak temin edilebilen yöntemler ile ilişkili özel ekipman maliyeti, kısmen, analitik laboratuar uygulanan bağlı değildir. Burada bir standart gerçek zamanlı kantitatif PCR makine kullanarak basitleştirilmiş bir analog okuma ile nükleik asitlerin miktarının belirlenmesi için bir son nokta dijital tahlil aç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
References
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O’Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- . Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip.. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. . Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- Hindson, B. J. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
