Isolering och karakterisering av neutrofiler med Anti-tumöregenskaper

Summary

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Abstract

Neutrofiler, den vanligast förekommande av samtliga vita blodkroppar i den humana cirkulationen, spelar en viktig roll i värdförsvar mot invaderande mikroorganismer. Dessutom neutrofiler spelar en central roll i immunövervakning av tumörceller. De har förmågan att känna igen tumörceller och inducera tumörcelldöd antingen genom en cellkontaktberoende mekanism som innefattar väteperoxid eller genom antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet (ADCC). Neutrofiler med antitumöraktivitet kan isoleras från perifert blod av cancerpatienter och hos tumörbärande möss. Dessa neutrofiler kallas tumörburna neutrofiler (TEN) för att skilja dem från neutrofiler av friska försökspersoner eller naiva möss som inte visar någon signifikant tumörcytotoxisk aktivitet. Jämfört med andra vita blodkroppar, neutrofiler visar olika flytkraft som gör det möjligt att erhålla en> 98% ren neutrofila populationen när det utsätts för en densitetsgradient. Men förutomden normala hög densitet neutrofila populationen (HDN), i cancerpatienter, i tumörbärande möss, samt under kroniska inflammatoriska tillstånd, olika låg densitet neutrofila populationer (LDN) återfinns i cirkulationen. LDN samrenas med den mononukleära fraktionen och kan separeras från mononukleära celler genom att använda antingen positiva eller negativa strategier för urvalet. När renheten hos de isolerade neutrofiler bestäms genom flödescytometri, kan de användas för in vitro-och in vivo-funktionella analyser. Vi beskriver metoder för övervakning av antitumöraktivitet av neutrofiler, deras förmåga att migrera och att producera reaktiva syreradikaler, samt att övervaka deras fagocytisk kapacitet ex vivo. Vi beskriver ytterligare metoder för att märka neutrofiler för in vivo-spårning, och för att bestämma deras anti-metastatiska kapacitet in vivo. Alla dessa tekniker är nödvändiga för att förstå hur du skaffar och karakterisera neutrofiler med antitumörfunktion.

Introduction

Neutrofiler ursprungligen karakteriserades som det medfödda immunceller, vilka fungerar som första linjens försvar mot invaderande mikroorganismer. Idag är det känt att neutrofiler har mer långtgående funktioner, vara delaktiga i montering adaptiva immunsvar mot främmande antigener ^1,2, som reglerar blodbildningen ^3, angiogenes ⁴ och sårläknings ^5. Dessutom kan neutrofiler påverka tumörtillväxt och metastasutvecklingen i kraft av deras pro- och anti-tumöraktiviteter ^6,7. Neutrofiler kännetecknas av en polymorf segmenterad kärna (därav kallas polymorfonukleära (PMN) leukocyter) och innehåller åtminstone tre distinkta underklasser av granulat samt sekretoriska vesiklar ⁸ (Figur 1A-C).

Neutrofiler har hög fagocytisk kapacitet och hög NADPH-oxidasaktivitet kritisk för mikrobiell eliminering, och utsöndrar ett brett spektrum av kemokiner som är viktiga för pådragning av ytterligare neutrofiler och andra immunceller till platsen för inflammation ^8,9. Neutrofiler kännetecknas av uttrycket av en stor mängd av ytreceptorer inklusive Toll-liknande receptorer (TLRs), C-typ Lectin Receptorer (CLR), komplementreceptor 3 (CD11b / CD18) och andra adhesionsmolekyler (t.ex., L-selektin, LFA-1, VLA-4 och karcinoembryoantigen relaterade celladhesionsmolekyl 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokinreceptorer (t.ex. CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemoattraherande receptorer (t.ex. PAFR, _LTB4 R och C5AR) , cytokinreceptorer (t.ex. G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptidreceptorer (t.ex. FPR1-3) och Fc-receptorer (t ex CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) och CD64 (FcyRI) ^10. Hos möss är neutrofiler vanligen identifieras som CD11b ⁺ Ly6G ^+, medan humana neutrofiler identifieras med hjälp av CD11b, CD15, CD16 och CD66b leukocyter markörer. Det är också allmänt accepterat att färga för granulproteiner myeloperoxidas (MPO) och neutrofilelastas (NE) för detektering av neutrofiler i vävnader.

Det är fortfarande oklart om de olika funktionerna hos neutrofiler förmedlas av samma cell eller olika cellunderpopulationer. Ackumulerande data tyder på närvaron av en heterogen neutrofil population som uppvisar en hög grad av plasticitet som påverkas av pro-inflammatoriska stimuli och mikromiljön ^11,12. Fridlender et al. ¹³ har grovt delas neutrofilerna i cancer i två stora delpopulationer kallas N1 med anti-tumöregenskaper och N2 med pro-tumöregenskaper. I cancer, såväl som vid kronisk inflammation, finns det ytterligare en subpopulation sammansatt av granulocytiska myeloida härledda suppressorceller (G-MDSCs) som undertrycker T-cellsvar ^14. G-MDSCs anses vara omogna myeloidceller som kännetecknas av en CD11b ⁺ Ly6C^låg Ly6G ^hej fenotyp i möss ^15, samtidigt som en CD15 ⁺ / CD16 ^låg fenotyp i mänsklig ^16. G-MDSCs uttrycka högre nivåer av arginas och myeloperoxidas, medan lägre nivåer av cytokiner och kemokiner än normalt cirkulerande neutrofiler. De är mindre fagocytiska och flyttande, men ger högre nivåer av ROS ^15,17,18. I föreliggande dokument kommer vi att beskriva några grundläggande metoder för isolering och karakterisering av neutrofiler med antitumöregenskaper.

Medan neutrofiler utgör den största befolkningen av alla vita blodkroppar i den mänskliga cirkulationen (45 – 70%, 1800 – 6000 / l), hos möss, under normala förhållanden, de är ganska glesa (10 – 15%, från 300 till 500 / il ). Neutrofilantalet ökar stadigt vid inflammation och ibland i cancer, som representerar ett tillstånd av kronisk inflammation ^7. Neutrofiler utvecklas från multi gemensam myeloid föregångare (CMP) cells i benmärgen, genom en differentieringsprocess som passerar de olika stadierna i myeloblaster (MB), promyelocyter (PM), myelocyter (MC), metamyelocyter (MM) och bandceller (BC) ^8. De mogna, efter mitotiska neutrofiler kan förbli i benmärgen 4 – 7 dagar innan de släpps till cirkulationen ^8. Neutrofil omsättning i blodet är vanligtvis snabb med en genomsnittlig halveringstid på 6 – 12 timmar, som kan förlängas i enlighet med inflammatoriska tillstånd. Ostimulerade neutrofiler har begränsad anti-tumörframkallande aktivitet, en funktion som kan förvärvas genom att exponera de naiva neutrofiler till kemokinerna IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 och CXCL5 ^6,19 eller artificiellt, genom att utsätta dem för forbolestem forbol 12 -myristate 13-acetat (PMA) ^6.

Den korta halveringstiden för blodneutrofiler tillsammans med det låga antalet neutrofiler (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ uppnås från en ml blod från en naiv 6-8 veckor gammal mus, har gjort detsvårt att utforska funktionen av cirkulerande mus neutrofiler in vitro. För att övervinna denna svårighet har andra källor använts. Exempelvis kan ett stort antal neutrofiler erhållas från benmärg ²⁰ eller bukhinnan efter induktionen av steril inflammation (t.ex., efter intraperitoneal injektion av tioglykolat buljong eller Zymosan A). Det bör noteras att neutrofiler erhållna från peritonealhålan inte utövar något antitumörframkallande aktivitet (opublicerad observation).

Et al. Granot ⁶ observerat att BALB / c-möss ympades ortotopiskt med musen 4T1 bröstkarcinom cellinjen utveckla neutrofili vilket förvärrar med tumörprogression ⁶ (figur 2A), så att 20 till 40.000.000 blodneutrofiler kan lätt isoleras från en ml blod 3-4 veckor efter tumörinokulering. Dessa neutrofiler har förvärvat anti-tumöraktiviteter, och har därför varit coibestämda tumörburna neutrofiler (TEN), i syfte att skilja dem från naiva neutrofiler ⁶ (Figur 2B). Medan hög densitet neutrofiler (HDN, Figur 1A) är starkt antitumörframkallande, låg densitet neutrofiler (LDN, Figur 1B) som genereras i samband med cancer är inte ^21. Även hög densitet neutrofiler från benmärgen och mjälten hos tumörbärande möss har anti-tumöraktivitet (opublicerade data). Det bör noteras att med tumörprogression mjälten blir gradvis förstorad (splenomegali), med ökande mängder neutrofiler.

Det bör noteras att TEN genereras också i andra modeller av cancer inklusive både spontana (MMTV-pymt och MMTV-Wnt1 brösttumörer och K-Ras-drivna lungtumörer) och injicerades (AT-3 (MMTV-pymt) och E0771 bröstkarcinom celler, LLC Lewis lungkarcinomceller och B16-F10-melanomceller). Men omfattningen av neutrofila mobilisering i dessa tumeller modeller är betydligt mindre än i 4T1-ympade möss, når 5 – 10 x 10 ⁶ neutrofiler i 1 ml blod efter 3 veckor.

Protocol

Djur: 5-7 veckor gamla BALB / c-möss köptes från Harlan (Israel). Alla experiment på djur har godkänts av Hebrew University institutionella Djurvård och användning kommittén (IACUC). Mänskliga prov: Insamling av blod från cancerpatienter och friska försökspersoner godkändes av Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB). 1. Induktion av neutrofiler med Anti-tumöregenskaper in vivo hjälp av en bröstcancer musmodell. OBS: Alla st…

Representative Results

I en nyligen genomförd studie identifierade vi en anti-metastaserande funktion för neutrofiler 6. Neutrofiler från tumörbärande möss förvärva en cytotoxiska fenotyp och har förmåga att döda tumörceller 6. Detta är i motsats till neutrofiler från naiva möss som inte har någon signifikant antitumöreffekt 6. Flera av de tekniker som beskrivits i protokollenheten har använts för att studera antitumör neutrofil funktion in vitro och in vivo-6. …

Discussion

Neutrofiler är den vanligast förekommande av alla vita blodkroppar och är de första responders i fall av infektion och inflammation. Som sådana är de mycket känsliga för yttre signaler och är lätt aktiveras. Dessutom neutrofiler har en mycket kort halveringstid och en snabb omsättning. Tillsammans utgör dessa egenskaper upp flera svårigheter att arbeta med neutrofiler, så att unika experimentella strategier krävs. Till exempel finns det flera neutrofila strategier renings, alla med sina egna fördelar och…

Materials

CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11