Visualización de condrocitos Intercalación y direccional proliferación a través de análisis celular clonal Zebrabow en el cartílago de la embrionaria Meckel
Summary
Organización celular de los huesos craneofaciales mucho tiempo se ha planteado la hipótesis pero nunca visualizada directamente. Etiquetado de células multi-espectral y en vivo vivo imágenes permite visualizar el comportamiento celular dinámico en el maxilar inferior del pez cebra. Aquí, detallamos el protocolo que manipulamos Zebrabow peces transgénicos y observamos directamente intercalación celular y los cambios morfológicos de los condrocitos en el cartílago de Meckel.
Abstract
Desarrollo de las estructuras craneofaciales vertebrados requiere una coordinación precisa de la migración celular, la proliferación, adhesión y diferenciación. Patrones del cartílago de Meckel, un primer arco faríngeo derivado, implica la migración de las células de la cresta neural craneal (CNC) y la división progresiva, la proliferación y la organización de los condrocitos diferenciados. Varios estudios han descrito la migración CNC durante la morfogénesis inferior de la mandíbula, pero los detalles de cómo los condrocitos alcanzar organización en el crecimiento y la extensión del cartílago de Meckel sigue sin estar claro. El SOX10 restringido y químicamente inducido Cre recombinasa recombinación mediada genera permutaciones de proteínas fluorescentes distintas (RFP, YFP y PPC), creando de este modo un etiquetado multi-espectral de células progenitoras y su progenie, lo que refleja poblaciones clonales distintas. Usando confocal fotografía time-lapse, es posible observar los condrocitos behavio durante el desarrollo del cartílago de Meckel el pez cebra.
Etiquetado celular multiespectral permite a los científicos para demostrar la extensión de los condrocitos de Meckel. Durante la fase de extensión del cartílago de Meckel, que prefigura la mandíbula, los condrocitos se intercalan para efectuar la extensión, ya que se apilan en una fila en capas de una sola célula organizada. El fracaso de este proceso de intercalación organizado para mediar en la extensión de células proporciona la explicación mecanicista celular para mandíbula hipoplásica que observamos en las malformaciones de la mandíbula.
Introduction
Desarrollo craneofacial requiere, interacciones celulares y tisulares moleculares complejas para impulsar la proliferación celular, la migración y la diferenciación 1,2, 3. Este proceso estrechamente regulado y complejo está sujeto a perturbaciones genéticas y ambientales, de tal manera que las deformidades craneofaciales se encuentran entre las malformaciones congénitas más comunes 1-9. Si bien las intervenciones quirúrgicas siguen siendo la base del tratamiento de anomalías craneofaciales, la comprensión de la base del desarrollo es esencial para innovar terapias futuras. Por lo tanto, el estudio de la morfogénesis y los mecanismos en la convergencia y la extensión y la integración de células proporciona nuevos conocimientos sobre la formación del esqueleto craneofacial 1.
Craneal migrar y la cresta neural pueblan el primer arco faríngeo, procesos mandibulares luego formar pares que se extienden para formar el cartílago de Meckel, que prefigura la mandíbula. Morfogénesis of cartílago de Meckel requiere organización condrocitos mediante la proliferación de dirección, la polarización celular y 1,10 diferenciación. Sin embargo, la complejidad de la organización de los condrocitos en el crecimiento y la extensión del cartílago de Meckel sigue siendo poco clara. Comprender el comportamiento celular dinámica es fundamental para comprender las malformaciones congénitas que afectan al tamaño de la mandíbula, como fenotipos mandíbula hipoplasia 11.
Embriones de pez cebra ofrecen muchas ventajas del desarrollo y genéticos para el estudio detallado de los cartílagos morfogénesis de Meckel. Su maleabilidad genética, la transparencia, la ex vivo y el rápido desarrollo son poderosas ventajas de préstamos bien para la observación del movimiento celular y la organización de imágenes en vivo 6. El uso de herramientas de trazado de linaje, como SOX10: línea transgénica Kaede, nosotros y otros han delineado los orígenes de la cresta neural del esqueleto craneofacial embrionaria 1,5. Using del SOX10: ERT2-Cre con el ubi: línea transgénica Zebrabow-M, ahora es posible explorar los detalles de los movimientos celulares durante el desarrollo craneofacial. El Zebrabow-M, es una línea transgénica diseñado con el promotor de ubiquitina de conducir la expresión de diferentes fluoróforos, cada uno flanqueado por sitios lox 8. El fluoróforo predeterminado Zebrabow-M es rojo, expresando RFP. Después de la inducción de la expresión de Cre, la Zebrabow-M construir recombina y células expresan una combinación de diferentes fluoróforos (RFP, CFP y YFP) la creación de expresión multi-espectral en el embrión. Todas las células hijas que dividen a partir de las células marcadas después del evento de recombinación son entonces clonalmente etiquetados, de modo que las poblaciones de células que se derivan de diferentes progenitores yuxtapuestas están etiquetados clonalmente. Por este etiquetado celular clonación, la proliferación de células y la migración con la resolución clonal pueden ser seguidos (Figura 1 y 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Líneas transgénicas azules y fotoconvertible Alcian como se ha descrito anteriormente complementa entre sí para definir el intrincado proceso de cartílago y desarrollo de los huesos. Sin embargo, la migración celular en vivo y la organización durante la organogénesis mucho tiempo se ha planteado la hipótesis e indirectamente demostrado pero nunca visualizó. Línea transgénica Zebrabow-M junto con un cartílago Cre específica permite la observación en vivo simultánea de todos estos eventos distintos implicad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Alex Schier para compartir amablemente la línea transgénica Zebrabow-M, Geoffrey Burns, para el vector pDEST y Renee Ethier-Daigle para un excelente cuidado de las instalaciones y líneas de peces.
FINANCIACIÓN:
Estamos muy agradecidos por el generoso apoyo financiero de NIDCR RO3DE024490 y Hospitales Shriners para niños (ECL) y becas de formación post-doctoral de los Hospitales Shriners para Niños (LR y YK).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
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