Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
Massiva diafysära bendefekter är en stor utmaning för ortoped. Benersättning med autolog bentransplantation, för närvarande anses vara den guldstandardbehandling, är i begränsad tillgång och är associerad med avverkning relaterad sjuklighet. Av dessa skäl har vävnadstekniska ben konstruktioner kombinerar benmärgs mesenkymala stamceller med osteokonduktiva byggnadsställningar undersökts som ett alternativ för auto inom ortopedisk kirurgi.
Hittills har de flesta av studierna har utförts på kliniskt relevanta djurmodeller såsom hundar, grisar och får 1-3, men preliminär utvärdering av dessa konstruktioner i orthotopic, segmentell, kritisk storlek bendefekter i små djurmodeller (som möss) kan ha flera fördelar: (i) låga kostnader, (ii) ett stort antal djur kan användas; (Iii) i motsats till stora djurmodeller, homogenitet musstammar begränsar individuella variationer i byggnadsställning resorption ennd benbildning och; (Iv) viktigast, tillgängligheten av specifika antikroppar och genmodifierade möss möjliggöra en utvärdering av den biologiska processen i benläkning. Sist men inte minst, gör det också möjligt användning av immunbrist musstammar studier med antingen transplantat eller celler av mänskligt ursprung utan skadliga immunsvar hos möss.
Trots de ovan nämnda fördelarna, massiva diafysära bendefekt modeller i möss är gles. De flesta av dessa modeller använder ben fixering med en märgstift som fyller benmärgen hålighet (vilket begränsar volymen av materialet som skall testas) och även hindrar reproducerbarhet genom att inte ge roterande och axiell stabilitet 2,4-7.
Målen för den aktuella studien är (i) att imitera en klinisk ben icke-union situation, att beskriva en reproducerbar, kritisk storlek, segment, lårbens defekt modell i möss, som stabiliseras genom noggrann och reproducerbar låsningsplatta osteosynthESIS som ger en mycket stabil biomekanisk miljö 8-10; (Ii) för att illustrera föreliggande modell med två potentiella bensubstitut och beskriva benbildning analyser som skulle kunna användas.
Ektopisk implantation av ortopediska-relaterat material och enheten i möss vanligen utförs för att bedöma benbildande kapacitet olika ställningar 13,14. Viktiga skillnader finns dock mellan ektopiska och orthotopic modeller, inklusive infödda osteogena signaleringsfaktorer och parakrina interaktioner med värd benbildande celler.
Föreliggande studie etablerar en reproducerbar murin stora segment, kritisk storlek lårbens defekt (3,5 mm, ca 20-25% av lårbenet längd). Med tanke på storleken av en sådan defekt och stabilitet som den resulterande plattan osteosyntes, härmar denna modell kliniskt stött atrofisk ben icke-union.
Den postoperativa tid som valts i den aktuella studien, är i linje med tidigare beskrivna icke-fack modeller möss, visar en brist på adekvat läkning efter 8 till 12 veckor 4,9,15,16.
Viktigast av allt, reproducible och stabil osteosyntes, såväl som stabiliteten hos de implanterade bensubstitut erhölls utan signifikant morbiditet och mortalitet 1,2 med användning av både låsplattan och en jigg för att utföra ostectomy. Detta resultat kontrasterar också resultaten redovisas när antingen en utvändig fixtur eller en märgspik användes 4,5,17-24. För de externa fixators potentiella nackdelar inkluderar: variabilitet i styvhet, infektioner av stiften skrifter, lossa av stiften, potentialer skador på grund av stiften och vikten av det material (4 till 20% av musens kroppsvikt). För den intramedullära spiken potentiella nackdelar innefattar: fyllning av märghålan med nageln och iatrogen skada på de artikulära ytorna.
Andra murina segmentell, kritisk storlek femorala defekter stabiliserade av plattan osteosyntes har beskrivits med bendefekt skapades av en Burr och mellan 1,5 och 2 mm längd 16,25. i the nuvarande modellen, användningen av en jigg och en såg tråd får en exakt 3,5 mm långa ostectomy utan betydande muskler trauma.
Men för att lyckas i att utföra proceduren man bör ta på övervägande flera viktiga punkter: Använd inte små möss (Naken möss med antingen en vikt under 25 g eller ålder under 8 veckor) annars plattan bör vara för lång. När man närmar sig lårbens ben, vara noga med att bevara både ischiasnerven caudally och ledkapsel distalt. Applicera plattan på den främre sidan av den femorala benet och sedan inriktning av plattan bestäms av tillämpningen av denna första skruven, ta hand för att placera plattan parallellt med lårbenet vid insättning denna första skruven.
Innan den ostectomy, ta hand för att utföra en cirkulär dissektion av lårbenet vid mitten av diafysen för att undvika muskeltrauma. När du utför ostectomy måste kirurgen assistent hålla fast styrningen och surGeon måste vara försiktig (i) att inte trassla sågen tråd, (ii) att använda de mittersta två tredjedelar av tråden samtidigt som en konstant stadig spänning, och (iii) för att undvika överskott rörelse för att få en rak ben snitt.
Benläkning är möjligt i den föreliggande modellen gav en bentransplantat används. Dessutom tillåter denna modell fortsatta studier av de mekanismer som är involverade i benersättning strategier när antingen mänskligt ursprung transplantat eller celler används i ett väl standardiserat, stora, segment, bendefekten.
Dessutom, i linje med nuvarande trender kräver förfining och minska användningen av djur inom ortopedi relaterad forskning, denna modell kan användas tillsammans med in vivo avbildningstekniker såsom bioluminescens. Sådana icke-invasiva tekniker gör det möjligt att övervaka både implanterade cellöverlevnad och vävnadsläkning utan att kräva djuroffer 26.
Stora begränsningar av föreliggande modell är bådebärande förhållanden och volymen av bendefekten skapas eftersom de inte fullt ut efterlikna de som påträffas kliniskt hos människa. Andra begränsningar i modellen är (i) radioopacitet av plattan, vilket kan kräva avlägsnande av plattan innan ex vivo μCT analys och kan komplicera tolkningen av de längsgående radiografisk undersökning resultat och, (ii) oförmåga att modulera plattan styvhet, som kan vara en viktig mekanisk parameter i benbildning 27-30.
Man måste hålla i minnet även när man använder antingen ben isograft eller andra ställningar som innehåller en mineralkomponent (särskilt kalciumkarbonat), att en del fördomar införs i segmenteringsprocessen av mikro CT analysen, eftersom nybildade bentäthet delvis överlappar antingen isograft densitet eller byggnadsställning densitet. Av denna anledning den benvolym erhålla genom mikro-CT-analys mestadels återspeglar volymen av mineraliserad vävnad (nybildade benet plusbenersättning) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Rena Bizios för hennes värdefulla synpunkter på manuskriptet.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |