चूहों में एक कमानी ऊरु महत्वपूर्ण आकार दोष मॉडल की स्थापना प्लेट osteosynthesis द्वारा स्थिर
Summary
Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
Abstract
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
Introduction
असीम diaphyseal अस्थि दोष आर्थोपेडिक सर्जन के लिए एक बड़ी चुनौती हैं। ऑटोलॉगस हड्डी भ्रष्टाचार के साथ बोन रिप्लेसमेंट, वर्तमान में सोने के मानक उपचार के रूप में माना जाता है, सीमित आपूर्ति में है और कटाई से संबंधित रुग्णता के साथ जुड़ा हुआ है। इन कारणों के लिए, ऊतक इंजीनियर हड्डी osteoconductive scaffolds के साथ अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम सेल के संयोजन निर्माणों आर्थोपेडिक सर्जरी में autografts के लिए एक विकल्प के रूप में लगाया गया है।
तिथि करने के लिए, अध्ययन के अधिकांश ऐसे कुत्ते, सूअर और भेड़ 1-3, लेकिन ओर्थोटोपिक, कमानी, महत्वपूर्ण आकार की हड्डी छोटे पशु मॉडल में दोष में इन निर्माणों की प्रारंभिक मूल्यांकन के रूप में नैदानिक प्रासंगिक पशु मॉडल में प्रदर्शन किया गया है (जैसे चूहों) के कई फायदे हो सकता है: (i) कम खर्च, (ii) जानवरों की बड़ी संख्या को संचालित किया जा सकता है; (Iii) बड़े पशु मॉडल के विपरीत, माउस उपभेदों की एकरूपता पाड़ अवशोषण एक में अलग-अलग रूपों की सीमाएन डी हड्डी गठन और; (Iv) सबसे महत्वपूर्ण बात, विशिष्ट एंटीबॉडी और जीन-लक्षित जानवरों की उपलब्धता जैविक हड्डी चिकित्सा में शामिल की प्रक्रिया के मूल्यांकन के लिए सक्षम है। पिछले नहीं बल्कि कम से कम, चूहों की immunodeficient उपभेदों का उपयोग भी चूहों में प्रतिकूल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बिना या तो ग्राफ्ट या मानव मूल की कोशिकाओं का उपयोग अध्ययन सक्षम बनाता है।
ऊपर उल्लिखित फायदे के बावजूद, चूहों में बड़े पैमाने पर diaphyseal अस्थि दोष मॉडल विरल हैं। इस तरह के मॉडल में से अधिकांश एक intramedullary पिन जो अस्थि मज्जा गुहा (इस प्रकार की सामग्री की मात्रा को सीमित करने का परीक्षण किया जा सकता है) भरता के साथ हड्डी निर्धारण का उपयोग करें और यह भी बारी-बारी से और अक्षीय स्थिरता 2,4-7 नहीं प्रदान करके reproducibility बाधा उत्पन्न करती है।
वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य इस प्रकार हैं: (i) एक नैदानिक हड्डी गैर संघ स्थिति नकल उतार, एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, महत्वपूर्ण आकार, कमानी, चूहों में ऊरु दोष मॉडल है, जो सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लॉकिंग प्लेट osteosynth द्वारा स्थिर है वर्णन करने के लिएESIS कि एक अत्यधिक स्थिर बायोमैकेनिकल पर्यावरण 8-10 प्रदान करता है; (Ii) दो संभावित हड्डी के विकल्प के साथ मौजूद मॉडल वर्णन करने के लिए और हड्डी गठन का विश्लेषण करती है कि इस्तेमाल किया जा सकता वर्णन करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
आर्थोपेडिक से संबंधित सामग्री और चूहों में डिवाइस के अस्थानिक आरोपण सामान्यतः हड्डी विभिन्न scaffolds 13,14 की क्षमताओं के गठन का आकलन करने के लिए किया जाता है। महत्वपूर्ण मतभेद हालांकि मूल निवासी osteogenic सिगनल कारकों और मेजबान बोन बनाने कोशिकाओं के साथ बातचीत पैराक्राइन सहित अस्थानिक और orthotopic मॉडल, के बीच मौजूद हैं।
वर्तमान अध्ययन एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य murine बड़ी कमानी स्थापित करता है, महत्वपूर्ण आकार ऊरु दोष (3.5 मिमी, फीमर लंबाई का लगभग 20-25%)। इस तरह के दोष के आकार और उसके एवज में प्लेट osteosynthesis द्वारा प्रदान की स्थिरता को देखते हुए, इस मॉडल चिकित्सकीय का सामना करना पड़ा atrophic हड्डी गैर संघ mimics।
पोस्ट ऑपरेटिव समय अवधि के वर्तमान अध्ययन में चुना है, पहले से वर्णित गैर संघ मॉडल चूहों के साथ कतार में है 8 से 12 सप्ताह के बाद 4,9,15,16 पर्याप्त चिकित्सा का अभाव दिखा।
सबसे महत्वपूर्ण बात, reproduCIBLE और स्थिर osteosynthesis, साथ ही प्रत्यारोपित हड्डी के विकल्प की स्थिरता महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर 1,2 दोनों लॉकिंग प्लेट और ostectomy प्रदर्शन करने के लिए एक जिग के उपयोग के साथ के बिना प्राप्त किया गया। यह परिणाम भी जब या तो एक बाहरी fixator या एक intramedullary नाखून 4,5,17-24 इस्तेमाल किया गया सूचना दी परिणाम विरोधाभासों। बाहरी fixators संभावित नुकसान में शामिल हैं के लिए: कठोरता में परिवर्तनशीलता, पिन इलाकों के संक्रमण, पिन का ढीला, पिन और सामग्री (4 20 माउस शरीर के वजन के% तक) के वजन के कारण चोटों क्षमता। intramedullary नाखून के लिए संभावित नुकसान में शामिल हैं: नाखून और जोड़ सतहों के चिकित्सकजनित क्षति के साथ दिमाग़ी गुहा के भरने।
अन्य murine कमानी, महत्वपूर्ण आकार ऊरु प्लेट osteosynthesis द्वारा स्थिर दोष एक गड़गड़ाहट और 1.5 से 2 मिमी लंबाई 16,25 से लेकर द्वारा बनाई अस्थि दोष के साथ वर्णित किया गया है। वें मेंई वर्तमान मॉडल, एक जिग और एक देखा तार के उपयोग के बिना महत्वपूर्ण मांसपेशियों को आघात एक सटीक 3.5 मिमी लंबी ostectomy की अनुमति दी।
हालांकि, प्रक्रिया एक विचार कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ले जाना चाहिए प्रदर्शन करने में सफल होने के लिए: (8 सप्ताह के तहत 25 ग्राम या कम आयु के या तो एक वजन के साथ नग्न चूहों) छोटे चूहों का प्रयोग न करें अन्यथा प्लेट भी लंबे समय के लिए किया जाना चाहिए। जब ऊरु अस्थि आ रहा है, दोनों sciatic तंत्रिका दुमदारी और जोड़ कैप्सूल distally बनाए रखने के लिए ध्यान रखना। ऊरु हड्डी के पूर्वकाल पक्ष पर प्लेट लागू करें और के बाद से थाली के संरेखण यह पहला पेंच के आवेदन के द्वारा निर्धारित किया जाता है, जब यह पहला पेंच डालने फीमर के लिए थाली समानांतर स्थिति देखभाल करने के लिए।
ostectomy करने से पहले, diaphysis के मध्य में फीमर के एक परिपत्र विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए पहलवान आघात से बचने के लिए ध्यान रखना। जब ostectomy प्रदर्शन, सर्जन के सहायक मजबूती गाइड और सुर धारण करना चाहिएGeon, सावधान (i) देखा तार उलझन नहीं होना चाहिए (द्वितीय), जबकि एक निरंतर स्थिर तनाव को लागू करने के तार के बीच दो-तिहाई का उपयोग करने के लिए, और (iii) अतिरिक्त आंदोलन से बचने के लिए एक सीधे हड्डी कटौती प्राप्त करने के लिए।
वर्तमान मॉडल में उपलब्ध कराई गई बोन ग्राफ्ट प्रयोग किया जाता है हड्डी चिकित्सा संभव है। इसके अलावा, इस मॉडल बोन रिप्लेसमेंट रणनीतियों में शामिल तंत्र है जब या तो मानव मूल के ग्राफ्ट या कोशिकाओं एक अच्छी तरह से मानकीकृत, बड़े, कमानी, अस्थि दोष में उपयोग किया जाता है की आगे की पढ़ाई के लिए अनुमति देता है।
इसके अलावा, शोधन और हड्डी रोग से संबंधित अनुसंधान के क्षेत्र में पशुओं के उपयोग में कमी लाने की आवश्यकता के मौजूदा रुझान के लिए लाइन में, इस मॉडल ऐसे bioluminescence के रूप में vivo इमेजिंग तकनीक के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के गैर इनवेसिव तकनीक पशु बलि 26 की आवश्यकता के बिना दोनों प्रत्यारोपित सेल अस्तित्व और ऊतक चिकित्सा निगरानी की अनुमति।
वर्तमान मॉडल की प्रमुख सीमाओं दोनों हैंलोड असर की स्थिति और क्योंकि वे पूरी तरह से मानव में चिकित्सकीय का सामना करना पड़ा उन नकल नहीं करते बनाया अस्थि दोष की मात्रा। मॉडल के अन्य सीमाओं (i) थाली के रेडियो-अस्पष्टता जो पूर्व vivo μCT विश्लेषण से पहले प्लेट को हटाने की आवश्यकता हो सकती है और अनुदैर्ध्य रेडियोग्राफिक परीक्षा परिणामों की व्याख्या और जटिल हो सकता है, कर रहे हैं (ii) प्लेट कठोरता मिलाना करने में असमर्थता जो हड्डी गठन 27-30 में एक महत्वपूर्ण यांत्रिक पैरामीटर हो सकता है।
एक है जब या तो हड्डी isograft या अन्य scaffolds एक खनिज घटक (विशेष रूप से कैल्शियम कार्बोनेट) युक्त का उपयोग कर, यह भी ध्यान में रखना चाहिए, कि कुछ पूर्वाग्रह सूक्ष्म सीटी विश्लेषण के विभाजन की प्रक्रिया में पेश कर रहे हैं, क्योंकि नवगठित अस्थि घनत्व आंशिक रूप से साथ छा या तो isograft घनत्व या पाड़ घनत्व। इस कारण हड्डी की मात्रा सूक्ष्म सीटी विश्लेषण से प्राप्त करने के लिए ज्यादातर mineralized ऊतक (नवगठित हड्डी की मात्रा को प्रतिबिंबित प्लसहड्डी स्थानापन्न) 11,26,31।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों पांडुलिपि पर उसे मूल्यवान टिप्पणी के लिए रेना Bizios का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
| Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
| Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
| Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
| Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
| Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
| Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
| Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
| Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
| Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
| 10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
| Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| 0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| 0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
| 5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
| 4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
| Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
| in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
| Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
| Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
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